western blot 蛋白印迹法

原理：固相载体（纤维素膜）吸附蛋白质作为抗原，相应的一抗结合上蛋白质，再与同位素或荧光标记的二抗结合，经过底物显色或放射性自显影的方法，以检测电泳分离的目的蛋白。 既可定性，也可半定量检测蛋白质。

一、提取蛋白

1、细胞数107，1*PBS洗涤细胞2遍（1500rmp 5min），转移到1.5ml EP管

2、冰上操作，加入裂解液50-100ul混匀。（蛋白裂解液：蛋白酶抑制剂=100：1）

3、插入冰盒30min，每10分钟震荡混匀一次

4、最高速离心，移上清至新的EP管中，记录液体体积数

5、取2ul 4液体至58ul的PBS中，稀释30倍，Eppendorf biophotometer plus（爱普多夫核酸蛋白测量仪） 测量蛋白浓度。

6、在4中加入1/4体积的5* loading buffer，混匀后99°C水浴变性10min（使之成为线性结构，暴露抗原），放  -40度保存

二、配胶   

1、玻璃板洗净：洗衣粉—自来水—双蒸水—烘箱烤干—齐、准、正向、上架子   

2、配胶 

30min，水胶分界清楚后胶凝。胶凝后滤纸吸出水层，上浓缩胶，上胶后立即上梳子，梳子平行插入，避免产生气泡。浓缩胶凝固后，将梳子竖直向上轻轻拔出（关键步骤，齿孔齐平！！）

  梳子两边加少量胶液，防止第一空变形。

3、用水冲洗浓缩胶，洗去孔内碎胶，将其放入电泳槽中。加足够电泳液后准备上样（电泳液要浸没玻璃钢，外侧加到1/3）

4、根据蛋白浓度，每孔蛋白30—100ug，上样约4—7ul，将头入孔加样，marker3—5ul。

5、接电源，80v起，蛋白跑到分离胶以后用100v 1h或90min，一直到溴酚蓝跑出胶即可终止电泳。

三、转膜

配转膜液（4度保存）

1、减好相应大小的纤维膜，并减去一角以标记。置于含有甲醇的平皿中浸泡1-2min（膜的仅仅要用的一面与甲醇接触并漂浮），切好的含目的蛋白的条带的分离胶一起放入转膜液中平衡5min。

2、湿转板上的顺序摆放：按照 （黑色）滤纸、胶、膜、滤纸（白色），注意赶走气泡。

3、放置靠近电极的一侧，110mv 1.5h，不超过2h。

  转膜时间的设定：

封闭液配置：用10%BSA或 5%脱脂奶粉：1g脱脂奶粉+1*TBST 20ml。

室温摇床2h。

五、孵育抗体

（滤纸吸去膜上多余的缓冲液，避免抗体被稀释）

1、用封闭液稀释一抗，将纤维素膜平铺于塑料袋内，加入一抗稀释液，使膜完全浸润，赶走气泡，室温摇床1h后4度过夜。（摇速10+）

2、次日，1*TBST在室温摇床上洗膜，1次10min，洗5—7次。（摇速50—70）

3、二抗用1*TBST按比例稀释后加入，室温摇床孵育2h（摇速慢）

4、1*TBST室温摇床洗膜3次

六、发光、显影、定影

1、准备X光片夹盒，将膜上多余液体去掉，平铺在有双层薄膜中间，加入现配的AB（1：1 混合至1—2ml），盖上薄膜，赶走气泡。

2、关红灯，取胶片根据荧光亮度调整压片时间，若是可见荧光压片1s即可。

3、取片放入显影液1min，水洗，定影液1—2min。

4、底片水洗后晾干保存。

注意：显影液使用3次+要更换，压片不好，可重新压片。

背景高的原因：

1、液的污染

2、封闭不充分

3、抗体与封闭剂交叉反应

4、抗体浓度过高