实验六 土壤中微生物的分离和纯化

日期11月24号 星期三90

一 实验目的

1 学习掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术 

2 了解不同微生物在液体,半固体,固体培养基上的培养特征

3 学习并掌握各种无菌操作接种技术

二 实验原理

1 微生物的分离纯化原理

自然条件下的微生物往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

在自然界中，上壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的。土壤中的微生物数量与种类非常多,在通气良好的花园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以花园土为材料分离土壤中的好气性细菌.

分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单菌落进一步分离纯化。在用稀释平板法分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。

2 微生物的培养特征原理

 1) 微生物的菌落特征

在固体平板培养基上，单个微生物细胞或孢子生长繁殖可以形成一个具有特定形状的菌落。在一定的培养基上和一定培养条件下，微生物的菌落特征是稳定的，因此通过菌落的观察可以识别细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等几大类微生物。菌落的基本特征包括菌落形状、大小、边缘、隆起度和颜色等。 

2)微生物的培养特征是指微生物培养在培养基上所表现出来的群体形态和生长情况. 一般可用斜面,液体,和半固体培养基来检验不同微生物的培养特征.它们培养在斜面培养基上,可以呈丝线状, 刺毛状, 串珠状,舒展状,树枝状或假根状. 生长在液体培养基内,可以呈浑浊,絮状,黏液状, 形成菌膜, 上层清晰而底部显沉淀状. 穿刺接种在半固体培养基中,可以沿穿刺线向四周蔓延, 或仅沿穿刺线生长, 也可上层生长得好,甚至连成一片,底部很少生长; 或底的好,上层甚至不生长.

3 微生物的无菌操作接种原理

1）斜面接种

2) 穿刺接种

三 实验器材

1 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,倒平板, 斜面,液体,半固体培养基.

2 器材：花园土，99mL无菌水1瓶，9mL无菌水4支，1mL头, 0.1mL, 直径9cm的无菌平皿，天平，试管架，无菌称量纸，酒精灯，火柴，接种环，涂布棒，记号笔等.

3 菌种: 金黄色葡萄球菌, 变形杆菌,枯草杆菌.

四 实验方法

1 倒平板:

在微波炉中将三角瓶内的培养基熔化, 取灭菌的培养皿, 每组倒12个平板.

2 土壤稀释液的制备 

称取1g花园土，无菌操作倒入99mL无菌生理盐水中,在震荡器中振荡20分钟, 使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-2稀释液；再用 lmL移液器，吸取10-2稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；再换一支无菌吸头吸取10-3稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，即成10-4稀释液；以此类推，连续稀释，制成 10-2、10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液。

3 平板涂布

将培养基平板编号，然后用移液吸取10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液各0．lmL对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设两个重复）。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，每个稀释度用一个灭菌涂布棒；更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。

4 培养

将涂布好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转。恒温37℃培养, 两天后观察.

5 连续划线分离: 

用灭菌接种环蘸取10-2稀释液一环于已凝固的平板上进行划线。划线可按以下两种方式进行：一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿约70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第二次划线部分，做第二次‘“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为连续划线法，是从平板边缘的一点开始．连续作紧密的波浪式划线，直至平板。转动培养皿 180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板。 

6 培养 将平板倒转, 恒温37℃培养两天后观察.

7 培养特征观察接种

分别取斜面,半固体和液体培养基,作好标记,分别按要求接种金黄色葡萄球菌, 变形杆菌,枯草杆菌. 

8 将接好的培养基置于37 37℃培养两天后观察.

9 环境中的微生物

 取一个平板移取皿盖,使培养基暴露在空气中; 将另一个平板移取皿盖, 放在一个较干净的环境, 半小时后将两个皿盖该上, 将平板倒转, 恒温37℃培养两天后观察.

10 体表不同部位的微生物

取一个平板, 用记号笔在平板背面化分为几部分,每部分标记好要检测的部位,如手,头发,衣服等, 可将洗手前后分别检测.然后用不同的人体部位按在标记好的平板部位上,将平板倒转, 恒温37℃培养两天后观察.

五 实验报告与思考题

1 在平板划线法中，为什么每次都需将接种环上的剩余物烧掉？

答：这样以后每次划线，微生物的数量都比上次划的线上少，就可能出现单菌落。

2 为什么要将培养皿倒置培养？

答：1、培养基很热，会产生水蒸气，水蒸气碰到培养皿的盖子就会冷凝成水珠，若正着放培养皿，水珠落下就会冲散菌落；

2、 倒着放，取培养皿的时候不易脱落，而且还可以防止污染；

3、可以使培养保持湿润。

3 怎样确定你所得到的单菌落是否是纯种. 

答：取得到的单菌落，制成稀释一定倍数的菌液，再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，在37℃下培养一段时间。将培养皿取出观察，形成的菌落特征是否一致，若形成的菌落形态均一，则说明得到的单菌落是纯种，若形成的菌落形态不均一，则不是纯种。

4 观察洗手前后微生物数量的变化。

答：洗手前后微生物数量没有很大变化。因为用来洗手的自来水、水龙头、空气中也有细菌。