苹果酸含量的测定苹果酸含量

（1）：进一步了解高效液相色谱仪的组成及各组件的功能。

（2）：加深了解外标法的定量原理以及外标法校正曲线的制作。

（3）：熟悉紫外检测器的特点和使用方法。

实验方案的设计；

高效液相色谱分析法：

今年来，随着高效液相色谱分析法的广泛应用，最近也已应用于有机物质的分离与测定，此法只需对样品进行离心或简单预处理，而不需要太多的分离处理手续，操作十分简单，其他组分的干扰少。高效液相色谱法最初用于有机物质分析时，采用强阴，阳离子交换色谱树脂的 通 离子排斥和分配色谱分离有机物质，以示差折光检测器或紫外分光检测器检测。最近由 键  料在HPLC上的应用，使得采用C18等反相柱分离食品中有机物质。高效液相色谱法

A原理：

    称校正曲线法。色谱分析中，在相同的操作下，用已知纯样品配成不同浓度的标准溶液进行试验，测量各种浓度下对应的峰高和峰面积，用峰高或峰面积对浓度做出标准曲线。样品分析时，将相同体积的分析样品进样，从色谱图上求出待测组分的峰高或峰面积，根据标准曲线查出样品中待测组分的含量。

B试剂：

市售的苹果、苹果酸为标准品、甲醇和磷酸为色谱纯、磷酸二氢钾为分析纯、实验室用水为二次蒸馏水。

C仪器：

   日本岛津公司的高效液相色谱仪，并与之配置的高压梯度泵、手动进样器、柱温箱、检测器、离心机。

D果实中有机酸的提起：

    将果实样品破碎除籽后研磨成粉状，之后准确称取1.000g样品，加入含0.008mol／L磷酸的蒸馏水25ml,在25摄氏度的水浴中震荡浸泡10min，然后在800r／min、4摄氏度的条件下离心20min，取上清液，用0.45pm的水系滤膜过滤后用与HPLC分析。

      C18色谱柱 、紫外检测器

有机酸定量方法：

     定量：采用峰面积外标法。

讨论与分析：

A流动相成分的选择：

    磷酸盐—磷酸体系是反相高效液相色谱法中常用的缓冲盐，常用的磷酸盐有KH2PO4，NH4H2PO4和NaH2PO4.本实验比较了流动相0.01mol／L（Ph=2.75）的KH2PO4和NH4H2PO4对有机酸色谱分离效果的影响，发现它们均可将各种有机酸有效分开，然而全波长扫描显示在紫外区KH2PO4。溶液本身的吸收值要比NH4H2PO4低，检测结果干扰较小，在210nm处，它们的吸收值分别为0.025和0.047，因此本实验选择KH2PO4。缓冲盐作为流动相。由于过高的缓冲盐对于泵和色谱柱容易造成损害，影响柱子的使用寿命，在本实验中流速为1ml/min，温度为25℃,用全波分析,采用0.02mol／L,PH=2.75(用盐酸调节至PH为2.75)的 KH2PO4低浓度（所占体积95%）的缓冲盐，并加以适量的纯甲醇（所占体积5%），以改善有机酸分离效果和峰形。

研究方法：

   目前，检测有机酸的方法有分光光度法，薄层色谱法，气相色谱法，液相色谱法。分光光度法以有机酸和一些特定物质的反应机理，能够生成在一定波长下的最大吸收峰的有色物质。但该法易受其他物质的干扰，通常需要将提取液进行沉淀，离子交换树脂等前处理纯化，因此步骤繁琐。气相色谱法的灵敏度和选择性相对较好，但是由于主要的短链有机酸是非挥发性酸，需要将有机酸衍生化，步骤较为繁琐，且常因为发生生化反应不易定量而直接影响检测结果的准确性，因而使气相色谱法的应用受到。高效液相色谱法是目前普遍采用的分析有机酸的方法，常用的反相高效液相色谱法（RT-HPLC）和离子交换色谱法。这两种方法中前者是用C18色谱柱，后者是用离子交换树脂柱。高效液相色谱法现广泛应用于 蔬及其制品中有机酸含量的测定。

磷酸的蒸馏水

的配制：

将磷酸溶液用蒸馏水稀释到1000ml的容量瓶中，是其浓度变为0.008mol／L磷酸的蒸馏水。

计算：磷酸分析纯的浓度CH3PO4=500*1.69*85%/98=7.32mol／L

有公式C1V1=C2V2得0.008mol／L*1L=7.32mol／L*V2

需要磷酸分析纯的体积V2=1ML

的配

制：

通过计算知配制10ug/ml的标准溶液需准确称量0.0674g苹果酸标准品，用蒸馏水溶解到50毫升容量瓶中定容。

计算：由m=CVM得m=0.0674g配制10ug/ml的标准溶液所需苹果酸标准品的质量

配制2ug/ml的标准溶液：有公式C1V1=C2V2得2ug/ml*25ml=10ug/ml*v2

                  需要10ug/ml的标准溶液    V2=5ml

以此类推得出4ug/ml，6ug/ml，8ug/ml需要标准溶液的体积为10ml，15ml，20ml

KH2PO4溶液

的配制：

将磷酸二氢钾溶液用蒸馏水稀释到1000ml的容量瓶中，是其浓度变为0.02mol／L，PH=2.75(用盐酸调节至PH为2.75)的 KH2PO4溶液。

计算：有公式m=cv*M=(0.02mol／L*1000ml/1000)*136

           需要磷酸二氢钾的质量m=2.72g

的配制：

特殊实验条件

山东谱图

甘肃谱图

浓度

高效液相图

特殊实验条件

山西谱图

山东图谱

甘肃图谱

产地：    

称取量：

     g  

体积：

ml

产地：

称取量：

      g

体积： 

ml

验

条

件：

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，模式为二元高压梯度。

验

条

件：

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，模式为二元高压梯度。

条件：

条件：

由于峰往后移了，检测出来的含量为零。所以用保留时间5.604，峰面积为69562计算得出浓度为13.96ug/ml。

用外标法计算。函数为F(x)=4975.23*X+123.23

得X=13.96ug/ml

苹果酸含量为W苹果酸=CVM/m

正常出峰

在保留时间4.357，峰面积10835时测得苹果酸浓度为2.334ug/ml

用外标法计算

函数为F(X)=5123.99*X-1125.04

苹果酸含量为W苹果酸=CVM/m

产地：    

称取量：

     g  

体积：

ml

产地：

称取量：

      g

体积： 

ml

验

条

件：

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，模式为二元高压梯度。

验

条

件：

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，模式为二元高压梯度。

条件：

条件：

由于峰往后移了，检测出来的含量为零。所以用保留时间5.593，峰面积为20080计算得出浓度为4.011ug/ml。

用外标法计算。函数为F(x)=4975.23*X+123.23

苹果酸含量为W苹果酸=CVM/m

正常出峰

在保留时间4.410，峰面积6672时测得苹果酸浓度为1.522ug/ml

用外标法计算

函数为F(X)=5123.99*X-1125.04

苹果酸含量为W苹果酸=CVM/m

产地：    

称取量：

     g  

体积：

ml

产地：

称取量：

      g

体积： 

ml

验

条

件：

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，模式为二元高压梯度。

验

条

件：

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，模式为二元高压梯度。

条件：

条件：

由于峰往后移了，检测出来的含量为零。所以用保留时间5.599，峰面积为69577计算得出浓度为13.36ug/ml。

用外标法计算。函数为F(x)=4975.23*X+123.23

苹果酸含量为W苹果酸=CVM/m

            =13.36*25*134/1.0123

            =44874ug/g

正常出峰

在保留时间4.410，峰面积5657时测得苹果酸浓度为1.324ug/ml

用外标法计算

函数为F(X)=5123.99*X-1125.04

苹果酸含量为W苹果酸=CVM/m

                  =1.324*25*134/1.0123

                  =4381ug/g

3.1通过苹果酸含量和高效液相色谱图比较得知：特殊实验条件泵B浓度95.0%（KH2PO4低浓度的缓冲盐），泵A浓度5.0%（纯甲醇）与泵B浓度90.0%（KH2PO4低浓度的缓冲盐），泵A浓度10.0%（纯甲醇）相互比较。在泵B浓度95.0%（KH2PO4低浓度的缓冲盐），泵A浓度5.0%（纯甲醇）时苹果酸含量较高，且色谱峰较佳。

3.2通过苹果酸含量和高效液相色谱图比较得知：苹果酸含量最多的是甘肃苹果，含量高达44874ug/g

3.3苹果酸对人体的好处：苹果中所含的苹果酸，对人体有七大好处：增强消化功能；降低有害胆固醇的水平；增强心脏功能；降低血压(维持正常的血压)；维持正常的血糖水平；使皮肤增白，保持皮肤的光滑滋润;清除体内重金属。

3.4、苹果酸的好处与应用：苹果酸为天然果汁之重要成份，与柠檬酸相比具有酸度大(酸味比柠檬酸强20%)，但味道柔和(具有较高的缓冲指数)，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂。 苹果酸是人体必需的一种有机酸，也是一种低热量的理想食品添加剂.饮料(各种清凉饮料)：苹果酸配制的软饮料解渴爽口，有苹果酸味，接近天然果汁。 苹果酸在医药行业的应用 在各种片剂、糖浆中配以苹果酸可以呈现水果味，并有利于在体内吸收、扩散。苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率；苹果还可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用，还用于制备与合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。 苹果酸的保健功能 苹果酸为人体内三羧酸循环的重要中间产物，人体内只有苹果酸脱氢酶，所以从结构和实际生理环境来看都必须利用苹果酸。实质上是参与一个新陈代谢和能量转化过程，蛋白质、脂类、糖类等最后都要经过三羧酸循环，这是转化过程的最后一步，也是最为重要的一步，关系到人体生理机能是否正常。而苹果酸的保健功效就在于防止人体由于苹果酸的缺乏导致三羧酸循环不正常，导致代谢失调。苹果酸具有生理活性，广泛地存在于生物体内。