实验-- 微生物

一.实验目的： 

1、明确培养基配制的基本原理； 

2、掌握培养基配制的一般方法和步骤； 

3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理和操作方法； 

4、认识微生物存在的普遍性。 

二.实验原理：

    培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。 

    培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。

    灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。

常用加热灭菌法：

1、干热灭菌：

    用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌

2、湿热灭菌

    ⑴高压蒸汽灭菌法  

    ⑵间歇灭菌法

⑶煮沸消毒法

三、实验材料

每组同学需要准备以下材料（14人/组）：

● 小试管：21支（15*150mm）

● 培养皿：60套（ф9cm）

● 移液管：15支(1000ml）、1支(10l)

● 三角玻璃棒：2支

● 瓷缸：1个（1000ml） 

● 三角瓶：3个（500ml)、1个（250ml)、2个（100ml) 

● 量筒：1个（100ml）

● 玻棒：1支

● 分液漏斗：1套

● 药匙：2把

● 标签贴纸：1张

● 记号笔：1支

四、实验步骤

培养基的制备过程

称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面 

1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。

配方：                牛肉膏       5 g

                             蛋白胨      10 g 

                               NaCl       5 g

                             蒸馏水    1000 ml

                               琼脂      20 g     (另称于三角瓶中)

2N  NaOH配制：

    1.量取80ml去离子水置于100-200ml塑料杯中。

    2.称取8g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌。

    3.待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液定容至于100ml。

    4.将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。

2.5N  HCL配制：

     1.在78.4ml的去离子水中加入21.6ml的浓盐酸，均匀混合。

     2.室温保存。

2.溶解

向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。 

3.调节pH值

用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。 

4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。

5.分装及包扎

根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。 

6.无菌水的制备   

无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），分别装自来水90mL和100mL，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。 

7.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌30分钟。

操作过程

加水 装锅 盖盖 加热 当压力升为0.5kg/cm2时排放冷空气 正式升压 保压（1.1kg/cm2，121℃，保持20-30min） 停止加热 自然降压至零 排放余汽 开盖 取出灭菌物品 趁热摆斜面 检验灭菌效果。 

8. 灭菌后试管摆放斜面

当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。

注 意 事 项

1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；

2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；

2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢； 

4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2 ； 

5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。

9.倒平板的方法

将培养基加热融化，待冷却至55－60 0C时，倒平板。 

每个培养皿中倒入15－20ml，铺平，制成平板。 

倒好的平板在超净台里吹去冷凝水备用。 

10.周围环境中微生物的观察

在牛肉蛋白胨平板上作如下实验：

①用未洗过的手指头在平板是涂抹 

②用肥皂洗过的手指头(不用毛巾擦)在平板是涂抹（用力一致） 

③用旧纸币在培养基上拖动 

④放置一根头发 

⑤打开培养皿置实验台上（空气中）10min

⑥按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min

⑦对着培养皿上的培养基咳嗽

⑧稍稍打开嘴唇压在培养基上 

以上用报纸包好倒置370C培养箱里培养48小时观察结果 

本次实验的任务:

配制1L牛肉膏蛋白胨液体培养基 

200ml                        600ml                     200ml                                                                                                                     

试管斜面                      固体                      液体

                             200ml                       50ml

                             3瓶                         4瓶

准备2瓶无菌水(90ml和150ml各1瓶)

             7支试管 

五、实验结果及分析

六、实验作业

1.牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？ 

2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查? 

3.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？

4.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

5.从周围环境中微生物的观察，你认为无菌操作应注意什么?

实验二  微生物的分离技术

一.实验目的： 

1、了解微生物分离和纯化的原理 

2、掌握几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术。 

3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。

二、实验原理

    在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。 

    为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。 

三、实验材料

☐   样品：    土样10g 

☐ 培养基：    牛肉膏蛋白胨培养基平板26皿

其它：   无菌水、试管、移液管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、接种环。

四、实验步骤

（一）土壤稀释液的制备  

① 称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中，振荡15～20分钟，使微生物细胞分散。 

②将土壤悬浮液置于沸水中煮10 ～ 20分钟，静置冷却，即成10-1的土壤悬液。 

③另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7，用移液管吸取10-1土壤悬液1ml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。再用另一个头吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml ，加入编号10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成10-3的土壤稀释液，一定要每次更换一个移液管（连续稀释）。同法依次分别稀释成10-6和10-7等一系列稀释度菌悬液 。

（二）平板接种培养 

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法

平板涂抹法（涂布法）

每组取牛肉膏蛋白胨培养基平板12皿。

在无菌平板编上10-4、10-5、10-6 、10-7号码，每一号码设置三个重复，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 

用移液管吸取相应的土壤稀释液0.1mL放在相应的平板上。

用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。 

牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于370C条件下培养，2～3d后，观察菌落形态及计数菌落，并计算出每g土壤中微生物的数量。如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。

（三）平板划线分离法

每组每人取牛肉膏蛋白胨培养皿1付（共14皿），在皿底贴上标签，注明事项。

用接种环取相应的菌液一环（10－3）在平板上划线。     

1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于37℃培养。    

 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约600角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于37℃培养。

（四）培养与移植  

   取倒置恒温箱中、培养2～3天的平板，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置于37℃恒温箱中培养，待菌落长出后，检查菌落是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养。

注 意 事 项

用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角应小些，动作要轻巧，以防划破平板。

 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。

 平板不能倒的太薄，最好在使用前一天倒好。为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 

（五）四大类微生物菌落形态的比较和识别

区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面的观察。

菌落形态：                                                                                                菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。                         

菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。

细胞形态：                                                                                       细菌——小而分散  酵母菌——大而分散                                                                      放线菌——丝状细                     霉菌——丝状粗 

五、实验结果及分析

请把分区划线的平板交到老师处，便于老师评价。

六、实验作业

1.试拟出从土壤中分离芽孢杆菌的主要实验步骤。 

2.在你所实验的培养基平板上长出的菌落属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。挑取细菌在试管斜面上保存？

4．培养时为什么要将培养皿倒置培养？

实验三  微生物数量的测定

一、实验目的 

学习平板菌落计数的基本原理和方法 

二、实验原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 

待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2-3或更多个细胞。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，使用菌落形成单位（colony-forming units,  cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 

   平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 

三、实验材料

菌种:

  稀释到10-4、10-5、10-6及10-7土壤悬液中的细菌

四、实验步骤

菌落计数规则：

1.计算相同稀释度的平均菌落数:

   有较大片菌落生长时，弃用，以无片菌落生长的平皿计数;

   若成片菌落大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数;

2.选择平均菌落数在30~300间的平板

1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；

2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：

   1）若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。

   2）若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。

 3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；

 4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；

所有菌落数均不在30~300间

以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数

每毫升样品中微生物细胞数=每皿菌落平均数×稀释倍数×1/取样体积数

注 意 事 项

1、在整个实验过程中的无菌操作。 

2、应根据实验所测的样品决定最高稀释度。

五、实验结果及分析 

你所取的土壤中细菌数量级为多少？ 

要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

准备培养基

100ml  牛肉膏蛋白胨液体培养基，pH 4.4

100ml  牛肉膏蛋白胨液体培养基，pH 6.0     第1组

100ml  牛肉膏蛋白胨液体培养基，pH 7.0

100ml  牛肉膏蛋白胨液体培养基，pH 8.4     第2组

实验四  理化及生物因素对微生物生长的影响

一.实验目的： 

1、了解温度、化学药品对微生物生长的 影响；

2、区别微生物的最适生长温度、pH与最适代谢温度、pH 。

二、实验原理：

    微生物生长繁殖要有一定的温度条件，不同的微生物要求不同的生长温度范围。在生长范围内又可分为最高，最适和最低三种生长温度。如温度超过最高或最低温度时，微生物均不能生长，或处于休眠状态，甚至死亡。 

    微生物的生长繁殖，需要一定的pH值范围，即环境中的氢离子浓度对微生物的生长繁殖有直接的影响，大多数细菌和放线菌适于中性或微碱性环境，酵母菌和霉菌则适于在弱酸性或酸性环境中生长，当环境的pH值超过其适于生长的范围时，微生物的生长则受到明显的阻抑或不能生长。

三、实验材料：

1.菌种 

   芽孢杆菌 

2.培养基

   牛肉膏蛋白胨琼脂平板

3.器具  

 2.5N  HCL、 0.1M柠檬酸、0.2MNaOH 

   酒精灯、接种环、冰箱、恒温箱

四、实验步骤

温度对酶活的影响

1．接菌按无菌操作方法进行

   在5个牛肉膏琼脂培养基平板上都接种上枯草杆菌，接种时划曲线或直线。

2．培养与观察

  （1）培养  将上述接好的菌种，分别放入0℃、15℃、30℃、37℃、50℃五种温度下培养。

  （2）观察  48小时后观察，记录实验结果。

pH对酶活的影响

1．调pH值  取足量分装为8ml的牛肉膏蛋白胨培养液7支，分别加入各种溶液，调成不同pH值的培养液;

2．按无菌操作方法，分别于各管中各接种芽孢杆菌0.2ml，分别标明试管序号;

3．另取8ml的牛肉膏蛋白胨液2支，按无菌操作的方法用无菌吸管移入无菌水2.2ml，使其体积也为10.2ml，作为对照;

4．将上述接种好的培养物置于37℃下培养。48小时后观察记载实验结果。

五、实验结果及分析 

1．记载实验结果，填入下表。

2．记载结果，填入下表： 

六、实验作业

1．高温和低温对微生物生长各有何影响？为什么？ 

2．氢离子浓度对微生物生长有何影响？

准备菌液

任选已保存2株菌摇菌

实验五  显微镜的使用和细菌的染色

一、实验目的 

1.了解并掌握油镜的原理和使用方法； 

2.掌握细菌革兰氏染色的原理和方法;

3.学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。

二.实验原理：

1.油镜工作原理

油镜的放大倍数最大(× 100)，故镜头焦距短，直径小，但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会因折射或反射而不能进入镜头，物象就显现不清。为了不使通过的光线所损失，须在油镜与玻片之间加入折射率和玻璃(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515)，故而称之为“油镜” 。

增加显微镜的分辨率： 

分辨率是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。D=0.61λ/n·Sinα/2   （其中D为分辨率；λ为波长，可见光为0.4～0.7µm；n为介质折射率，α为物镜镜口角，即光线的最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120度）。油镜是通过增加n值来提高介质的分辨率的 。

显微镜的构造                             

1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、  虹彩光圈、  反光镜等)。它使检视物放大,生成物象。

2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。 

显微镜的放大倍数和分辨率

1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放大倍数                                    2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为：

D=λ/2n·sin(α/2 )

 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。                                    ：可见光的波长（平均0.55 m)                          

 n: 物镜和被检标本间介质的折射率。                      

  ：镜口角（即入射角）。 

油镜使用的原理               

 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

显微镜保养和使用中的注意事项

1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。

2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度

3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。

4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。

5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

2. 革兰氏染色的工作原理：

革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。

根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结构差异来达到染色的目的的。

先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝紫色；

然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

然后再用乙醇脱色处理

由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫—碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。

而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫—碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染

剂的颜色（红色）。

三、实验材料

1、菌种：培养24h的芽孢杆菌，培养24h的大肠杆菌

2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、95%酒精、蕃红染液、香柏油、无菌水 

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。

四、实验步骤： 

1. 显微镜油镜观察的操作方法：

☐   在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到最合适的观察点。

☐    油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

2. 革兰氏染色的操作方法

制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→观察

（1）制片：取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固定；

（2）涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰1—2次即可。 

注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。 

（3）初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染1-2分钟min，水洗。

（4）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

显微操作

1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察

2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。

3.换片：另换新片，必须从第一条开始操作。

4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。

注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头

             实验结束请确保油镜头擦拭干净！

五、实验结果及分析

在用显微镜观察（左眼观察）的同时，在实验记录本上画下你所观察到的细菌的形态图，并注明A和B的革兰氏染色的反应性。 

1.结果记录： 

六、实验作业

1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？

2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？

3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？