分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性

【实验原理】

蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。

UDPG+果糖---蔗糖+UDP

这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：

UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+

6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。

【实验材料】

植物茎

【仪器设备及设备】

冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱

【试剂药品】

1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl  2,2mmol/LEDTA-Na   2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液 

【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

2.透析缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。

3.酶反应液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果糖（10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖） 2mmol/LEDTA-Na2, 5mmol/L 醋酸镁，5mmol/LDTT。

5mM Tris-HCl配法：50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与45.7毫升0.1M盐酸混匀后，加水稀释至100毫升。这是pH7.1的 您要7.0的话便再加一些HCl 用pH计调到7.0。.50mM NaCl pH=7.0配法：端直称2.92 g NaCl，加水到1 L然后用0.1 M盐酸或者0.1 M NaOH调pH到7.0

4.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随用。尿苷二磷酸葡萄糖

5.2mol/LNaOH

6.30%HCl

7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。

8.1mg/ml蔗糖标准液

【方法步骤】

1.酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。

2.蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。

3.蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2mol/LnaOH 0.1ml,沸水浴10min后，冷却至室温。加30%HCl3.5ml, 0.1%间苯二酚1ml，摇匀后于80度保温10min, 冷却后480nm处比色，测定蔗糖生成的量。

4.蔗糖磷酸合成酶反应：在酶反应液中用10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法测定。

5.标准曲线制作：取7支10ml具塞试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。

酶活力（mg蔗糖/(g*FW*L)）=C*Vt*n/(FW*t*Vs)

式中：C是从标准曲线查得的蔗糖量（mg）；FW是样品鲜重（g）;t是反应时间（h）；Vt是提取酶液总体积（ml）；Vs是测定时取用酶液体积（ml）；n是提取液测定中的稀释倍数。

【注意事项】透析袋不可装满，以防止吸水涨破。

蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、（SPS）是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内的功能有所不同。蔗糖合成酶（SS）以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。

蔗糖的合成（二条途径）：

1、蔗糖合成酶 （非光合组织）

UDPG+果糖 →蔗糖+UDP

2、磷酸蔗糖合成酶（光合组织）

UDPG+F-6-P→ 磷酸蔗糖+UDP

磷酸蔗糖+H2O→ 蔗糖+Pi

一、仪器设备

冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计

二、试剂

HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；

0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖

三、操作方法

1、粗酶液制备

称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。

HEPES分子量为238.31，化学名：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，分子式: C8H18N2O4S

2、酶活性测定

依次加入 50μL粗酶液，

50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，

20μL 50 mmol/LMgCI2，

20μL 100mmol/L UDPG，

20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），

30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1%间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：

取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算

样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=

式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；

     V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；