干扰设计方法

使用siRNA来实现基因沉默是在分子生物学方面进展迅速的方法.有几种制备siRNA的方法,比如化学合成,体外转录,siRNA表达载体,和PCR表达盒.不管用那种方法,设计siRNA的第一步是选择siRNA的目的位点.下面选择siRNA目的位点的指南是基于当前文献和在Ambion的科学家们的观察经验.用这些指南,设计出的所有siRNA干扰片段中,其中大约有半数可以产生目的基因mRNA转录水平大于50%的下降.

当前,Ambion已与在RNAi研究领域的领头人—Cenix BioScience合

伙.Cenix已经提出了一个具有专利权的siRNA设计运算法则,当与按照下面的设计路线设计的siRNA相比,可以产生更高的有效siRNAs比例.对于运算法则的信息,可以参看设计更好siRNA部分.你可以从Ambion订购你提前设计好的，根据Cenix运算法则用化学法合成的siRNA.当前对于在RefSeq数据库中的人类，小鼠和大鼠基因，超过98%的siRNA是可以设计出来的.想得到更多信息，可以参看提前设计的siRNA目录页.而且，Ambion提供对许多重要的人类基因行之有效的siRNA沉默子.这些siRNAs被实际测试核实后，发现可以致使目的基因mRNA水平大于70%的下降.

一．总体的设计指导方针

如果你喜欢自己设计siRNAs，你可以根据下面的指导方针，在许多不同的生物体中选择siRNA目的位点.相应的siRNAs可以被化学合成，通过体外转录产生，从载体中表达或者用PCR扩增.

1.在目的mRNA中找出以AA二核苷酸开头的21个核苷酸序列.

● 从AUG转录起始密码子开始，寻找AA二核苷酸序列.将每一个AA二核苷酸和它的3’端的19个核苷酸序列记录下来，作为可能

的siRNA目的位点.

● 这种选择siRNA目的位点的策略是基于Elbashir et al的观

察报告.(1)3’端有UU的二核苷酸siRNAs是最有效的.这也同用RNA

聚合酶III转录发夹siRNAs是相一致的，因为RNA聚合酶III是在

有4-6个聚合T的位置终止转录的，从而产生带有短的聚合U尾巴的

RNA分子.

● 在Elbashir的和随后的出版物中，3’端带有其它末端二核

苷酸的siRNAs也可以有效的介导RNAi.如果你愿意的话，你可以更

改这种目的位点的选择策略，使设计的siRNAs带有其它的末端二核

苷酸，但有一点，我们推荐你尽量避免末端为G残基，因为这样的

话，就极有可能被RNA酶在单链上G残基的位点将siRNA切断.

2.选择2-4个目的序列.

在Ambion的研究发现，一般超过半数的随机设计的siRNAs可以致使目的mRNA的转录水平至少降低50%，并且大约有四分之一的siRNAs能使目的mRNA的转录水平下降75-95%.根据下面的指导方针，从第一步中记录的序列中选择目的位点：

● Ambion的研究者们发现G/C含量在30-50%的siRNAs比有更高G/C

含量的siRNAs更具有活性.

● 既然对于RNA聚合酶III来说，4-6个核苷酸聚合T的位点是作为

一个转录的终止信号，所以在设计要从RNA聚合酶III启动子处表达的

siRNA时，要避免含有延伸超过4个T或A的目的序列.

● 既然mRNA的某些区域可能被蛋白质高度组装或结合，我们一

般沿着基因序列，在不同的位置来选择siRNA目的位点.我们迄今为止，

还没有发现在mRNA上的目的位点的位置与siRNA能力有任何相关性.

● 比较可能的目的位点与合适的基因组数据库（人类，小鼠，大鼠，

等等）以及排除带有超过16-17个邻近碱基的目的序列与其他编码序列的同源性的考虑，我们建议用BLAST软件，这个可以在NCBI服务器上找

到:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

3.设计合适的控制.

一个完整的siRNA实验应该包含有许多控制来确保数据的正确性.自然细胞生物学的编辑推荐了几个控制.其中的两个表述如下：

● 一种是负控制的siRNA，它跟你设计的siRNA有着相同的核苷酸

组成，但是与基因组序列缺少大的序列同源性.要设计一种负控制的

siRNA，先打乱特异性基因的siRNA的核苷酸序列，然后在基因组序列中

进行搜索来确保它缺少同任何其它基因的同源性.

● 额外的针对相同的mRNA的siRNA序列.也许进行实验是确定RNAi

数据有效的最好的方式，在某次用一种siRNA时，连同针对同一个基因

的两个或者更多的不同的siRNA一同使用.在进行这些实验之前，应该测

试每一个siRNA，确保它能在相当高的水平上可以降低目的基因的表达.

二．Ambion的siRNA目标位置寻找程序

使用我们的在线目标位置寻找软件来找出可能的序列，是基于上面的设计指南.只用简单地把你的mRNA序列粘贴到窗口中，这个程序就会扫描你的序列来找出AA二核苷酸.并且产生出一个报告，显示AA二核苷酸的位置，21个目的碱基，相应的有义和反义siRNA寡核苷酸链.然后目的siRNA可以被直接提交到我们的特异设计工具中，或者通过点击目的siRNA下感兴趣的相应链接，来进行BLAST 搜索.

另一个可供选择的是，位于MIT（麻省理工学院）的Whitehead生物医学研究学院有一个公开可用的siRNA设计工具，可以进行额外参数选定，并且整合有人类和小鼠基因组数据库的BLAST搜索.参看：

http://iona.wi.mit.edu/siRNAext/（需要注册）.

三．对于设计siRNA表达载体和siRNA表达盒编码的siRNA发夹结构的详细指南

最初报道的用siRNA表达载体来诱导RNAi的研究者们在对于编码表达siRNA的插入序列有各不相同的设计标准.绝大多数的设计中都含有被用一小段间隔序列分开的两段反向重复序列，并且以一系列的作为转录终止位置的T来结束.这些设计产生的转录RNA，被认为会折叠成如图一所示的一段短的呈发夹结构的siRNA.但诸如，siRNA目的序列的选择，编码推定的发夹结构茎的反向重复序列的长度，反向重复序列的前后次序，编码发夹结构环的间隔序列的长度和组成，5'-突出末端的存在和缺失，在不同的报道中都是有所差异的(3-11).

图一.siRNA表达载体或者siRNA表达盒产生的典型发夹siRNA的示意图及它同RNA目的序列的关系.

四．Ambion推荐的设计siRNA发夹结构的程序

下面的介绍的siRNA发夹结构的设计和克隆策略是基于Ambion的科学家们的研究结果.设计合适的插入序列的第一步是按照上面表述的总体的设计指导方针的步骤来选择siRNA目的位点.

为了筛选，我们一般对每个目的基因测试四个siRNA序列，并且让这几个siRNA序列沿着基因序列间隔排布，目的是为了减少目地mRNA区域正好与蛋白质组合或结合的机会.因为对每个目的基因都组装并且检测四个siRNA表达质粒是很费时间的，我们发现用源于siRNA表达盒(SECs)的PCR产物法来筛选可能的siRNA序列是容易多了.SECs是指包含有启动子和终止子序列，并连接有发夹结构siRNA模板的PCR产物，可以被制备成Ambion的沉默子的表达工具.这种筛选策略也可以对在实验系统中的启动子和siRNA序列的最好结合进行快速的鉴定.被发现可以有效使得基因沉默的SECs可以被很容易地被克隆进一个载体，从而进行长期的研究.Ambion的科学家们已经确定那些作为转染siRNAs有很好功能的序列在作为vivo中表达的siRNAs时一样有很好的功能.唯一的差别是在vivo中表达的siRNA序列不应该含有一系列的四个或五个A或T，因为这些能作为RNA聚合酶III识别的终止位点.

对于传统的克隆进载体PSilencer的方法，编码选定的siRNA序列的两条DNA寡聚核苷酸链被设计插入到载体中.（图2和图3）.一般而言，DNA寡聚核苷酸链是由19个有义siRNA序列靠一段短的间隔子与它的颠倒的互补的反义序列相连构成的.Ambion科学家们已经成功使用了9个核苷的间隔子(TTCAAGAGA)，尽管其它的间隔子也能被设计.5-6个T被加到寡聚核苷酸的3’端.而且，为了克隆到PSilencer 1.0-U6载体中，EcoR I和 Apa I性酶切位点被分别加入到DNA 寡聚核苷酸链的5’和3’末端（图2）.与此相对的是，为了克隆进pSilencer 2.0-U6, 2.1-U6, 3.0-H1, or 3.1-H1载体中，BamH I和 Hind III性酶切位点被分别加入到DNA寡聚核苷酸链的5’和3’末端（图3）.预期的RNA转录产物将会向后折叠，形成茎-环结构，茎由19bp组成，环由9个核苷酸组成，并且在3’末端有2-3U（图1）.

图2.对于载体pSilencer 1.0-U6的插入部分的设计.这个插入部分对于pSilencer 1.0-U6载体是特异性的，并且包含有适当的3’overhangs，为了能按一定方向克隆进这个载体.环的序列和长度能按照希望的进行改变.

图3.对于载体pSilencer 2.0-U6和 pSilencer 3.0-H1插入部分的设计，设计的插入序列对于pSilencer 2.0-U6, 2.1-U6, 3.0-H1和 3.1-H1表达载体是特异性的，并且包含有适当的5’突出末端，是为了按方向克隆进这些质粒中.对于在图2中显示的pSilencer 1.0-U6载体，早期有迹象表明，在环结构设计中，有大量的区域都可用；这里我们提供了我们发现很好的一个环的序列.

为了克隆进pSilencer adeno 1.0-CMV载体，为此设计的带有茎-环结构的DNA寡聚核苷酸链与上面表述的克隆进pSilencer 2.0和 3.0载体的结构很相似.尽管如此，对于基于CMV的载体的寡聚核苷酸链的一个显著的差别是它的3’末端5-6个T的缺失，因为对于基于CMV的载体系统的转录终止信号是由SV40聚合A终止子提供的.而且，为了克隆进pSilencer adeno 1.0-CMV载体，Xho I和 Spe I性内切酶酶切位点被分别加入到DNA寡聚核苷酸链的5’和3’末端（图4）.尽管如此，为了克隆进pSilencer 4.1-CMV载体，包含有Bam H1和 Hind III

性酶酶切位点的核苷被分别加到DNA寡聚核苷酸链的5’和3’末端（图5）.

图4.对于pSilencer adeno 1.0-CMV载体插入部分的设计.插入部分的设计对于pSilencer adeno 1.0-CMV载体是特异性的，并且包含有合适的突出末端，为了可以按方向克隆进这个载体.环的序列和长度可以按需要进行改变.

图5.对于pSilencer 4.1-CMV载体插入部分的设计.插入部分的设计对于pSilencer 4.1-CMV载体是特异性的，并且包含有合适的突出末端，为了可以按方向克隆进这个载体.环的序列和长度可以按需要进行改变.

通过沉默子表达工具用PCR方法制备包含有H1或者U6启动子的SECs，（1）一个或两个编码siRNA序列的DNA寡聚核苷酸链被设计和订购，（2）寡聚核苷酸链在一个或多个PCR中用做引物，PCR中包含有含有启动子的来自于现成工具的模板，（3）PCR产物经过柱层析纯化.尽管其它的环序列也可以被设计，但Ambion 的科学家们一般用5'-UUUGUGUAG-3'环结构来进行他们的SECs.对于载体插入部分的设计中，作为RNA聚合酶III终止子的一段5-6个T终止序列被加入.为了随后克隆的便利，EcoRI和 HindIII性酶切位点也加入引物序列中.用沉默子表达工具来设计寡聚核苷酸链引物的详细设计参数可以被在工具的操作工序说明书中找到.

为了将源于SECs的功能性沉默子表达工具克隆进载体，SEC和目的载体都需要用EcoRI和 HindIII进行酶切.制备被称作pSEC载体，即带有新霉素，潮霉素，嘌呤霉素抗性基因的线性化的目的载体，是可行的.

五．siRNA目标的选择

除了Cenix改进的运算法则和我们建议的程序，通过扫描mRNA序列中的AA 二核苷酸并记录下紧挨着AA的19个核苷酸，依此来作为siRNA的目标位置外，其它两种方法已经被其它的研究者所采用.在第一个方法中，siRNA目标序列的选择纯粹是由经验决定的（4），只要目标序列以GG开头，并且通过BLAST分析同其它基因没有很大的序列同源性.

在第二个报道中，又一个精心设计的方法被采用来选择siRNA目标序列.这个程序采用了观察方法，即在内在的mRNA中，能被合成的寡脱氧核糖核苷酸酶/RNase H降解的目标位置，就是可以被利用的位置（5）.在这种方式中鉴定出的任何可利用的位点被用作在含有启动子的U6中siRNA结构的插入序列.

六．在发夹结构siRNAs中的有义链和反义链的次序一个发夹结构siRNA表达盒经常被构建成包含有目标基因的有义链，紧跟着一小段间隔子，然后是目标基因的反义链的这样一种次序.一组研究者已经发现颠倒在siRNA表达结构中的有义链与无义链次序并没有影响发夹结构siRNA（6）的基因沉默活性.与此相反的是，另一组研究者发现在另一个siRNA表达盒中相似的次序颠倒则造成了发夹结构siRNA（7）在导致基因沉默活性方面的部分下降.对于究竟是什么原因致使出现这种差别还并不清楚.在当前，仍然被认为合理的siRNA表达盒的构建次序依次为，有义链，短的间隔子，反义链.七．siRNA茎的长度

在用做siRNA表达盒茎结构的核苷酸序列的长度选择上，有着不同程度的差异.一些包括Ambion的研究组织用19个核苷长度的序列作为siRNA表达盒的茎结构（6-10）.与此相对的是，其它的研究组织所用的siRNA茎长度，从21个核苷长度（4-5）到25-29个核苷长度（11）不等.但发现这些有不同茎长度的发夹siRNAs在基因沉默研究中都有很好的功能.

八．在发夹结构siRNA中连接有义链与反义链的环的长度和序列

不同的研究组织已经成功报道了用带有从3-23个核苷环的发夹siRNAs实现基因沉默的结果（4，6-9，11）.下面是对被不同研究组织使用的环长度和序列结构所做的总结：

环长度（核苷）特异环序列使用的科研组织数

3AUG4

3CCC7

4UUCG5

5CCACC7

6CTCGAG26AAGCUU2

7CCACACC7

9UUCAAGAGA6

23没有报道9

九．在发夹siRNAs中5’突出末端的出现

绝大多数研究组织在他们的发夹siRNA结构中没有加入5’突出末端（4-8，10-11）.尽管如此，一个研究组织在发夹siRNA结构（9）中加入了包含有6个核苷的5’突出末端.这些含有5’突出末端的发夹siRNAs在基因沉默中也是有功能的.

十．siRNA的化学合成

Ambion合成顾客设计的siRNAs和用Cenix运算法则提前设计的siRNAs.为了订购用化学合成的，你已经设计好的siRNA，你可以提供：

● mRNA序列上的21个碱基（以AA二核苷酸开始），依次来指导siRNA

的合成.

或者

● 每个siRNA链的序列（如果你想让你的siRNA具有除了dTdT或着 UU

的3’末端，我们推荐你用这个.）

Ambion将根据你提供的序列，来合成siRNA寡聚核苷酸链互补序列.默认情况下，你只提供mRNA目标序列的话，相应的带有dTdT 3'突出末端的siRNAs将被合成.如果你愿意的话，你可以选择UU或者其它的突出末端.我们的科学家们发现带有dTdT或者 UU突出末端的siRNA在功能方面并没有差异.（注意：有义链3' dTdT不必非得跟目标基因互补.）

当前，Cenix设计的siRNAs，对于保存在NCBI上RefSeq数据库中的大于98%的全人类，小鼠和大鼠基因组序列，都是可用的.为了订购一个提前设计的siRNA，首先在我们的siRNA数据库中搜索你感兴趣的基因，然后选择你想要支付的设计方案，将它们加入你的购物车里，并且传过来关于我们的在线定货单的相关信息.参看在Cenix设计运算法则中的设计一个更好的siRNA的相关信息.

十一.其它的siRNA制备方法

通过体外转录，siRNA表达载体，或者用PCR产生siRNA及用表达盒来制备siRNA时，合适的模板必须被制备.网上的对于下面的Ambion工具/产物的在线模板设计工具都是可供使用的.

siRNA沉默子结构试剂盒 [产物信息] [设计工具] PSilencer siRNA表达载体 [产物信息] [设计工具]

沉默子表达siRNA表达盒试剂盒 [产物信息] [设计工具]

沉默子siRNA鸡尾酒试剂盒（Rna酶 III） [产物信息]

这些从上面表述的siRNA目标寻找程序里也可以获得.

参考书

1. Elbashir, et al. (2001) Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J 20: 6877-6888.

2. Editors of Nature Cell Biology (2003) Whither RNAi? Nat Cell Biol. 5:4-490.

3. Brown, D., Jarvis, R., Pallotta, V., Byrom, M., and Ford, L. (2002) RNA interference in mammalian cell culture: design, execution, and analysis of the siRNA effect. Ambion TechNotes 9(1): 3-5.

4. Sui, G., Soohoo, C., Affar, E.B., Gay, F., Shi, Y., Forrester, W.C., and Shi, Y. (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520.

5. Lee, N.S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M.-J., Ehsani, A., Salvaterra, P., and Rossi, J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20 : 500-505.6. Yu, J.-Y., DeRuiter, S.L., and Turner, D.L. (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) : 6047-6052.

7. Paul, C.P., Good, P.D., Winer, I., and Engelke, D.R. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508.

8. Brummelkamp, T.R., Bernards, R., and Agami, R. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296 : 550-553.

9. Jacque, J.-M., Triques, K., and Stevenson, M. (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 418 : 435-438.

10. Miyagishi, M., and Taira, K. (2002) U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs effectively suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnology 20 : 497-500.

11. Paddison, P.J., Caudy, A.A., Berstein, E., Hannon, G.J., and Conklin,

D.S. (2002) Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Devel. 16: 948-958.

英文原文：http://www.bioon.com/experiment/rna/rna6/200408/62924.html