1150817803结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书

【产品名称】

通 用 名 称：结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)

【包装规格】32人份/盒

【预期用途】本试剂盒用于定性检测患者痰液中结核分枝杆菌核酸,可作为临床结核分枝杆菌检测的辅助手段。

适应症：由结核分枝杆菌感染引起的肺结核、肠结核、结核性腹膜炎等疾病。 【检验原理】本试剂盒选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Tap酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，既能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对结核分枝杆菌核酸的自动化检测。

【主要组成成份】

组成 组成成分 规格

核酸提取液 含0.5％Triton-100、5％Chelex-100 1.8mL×1

TB反应混合液 含Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、引物、荧光探针 1.2mL×1

Taq酶含TapDNA酶及抗体 14μL×1

阳性对照品 主要成分为含TB基因组DNA（重组克隆）人工构建的质粒100μL×1

阴性对照品 主要成分为TE Buffer 100μL×1

注：不同批号试剂盒中各组份不可以互换。

【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳

定性，但试剂反复冻融不得超过三次。

【适用仪器】

具有FAM荧光通道的ABI 7300 、ABI 7500 荧光PCR扩增仪。

【样本要求】

1.标本：人痰液。

2. 采集：将患者用力咳出肺深部的痰液采集于无菌样本保存管，密闭送检。采集具体方法

请参考《微生物标本采集手册》一书。

3. 存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，

但应避免反复冻融。

4. 运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。【检验方法】

1. 样本处理【样本处理区】

（1）在待测痰液中加入4倍体积的4% NaOH，混匀，室温下放置30min至1h使其充分液化；

（2）取液化后的样本0.5mL于1.5mL离心管中加入0.5mL 4% NaOH后放置10min，13,000rpm 离心10min；

（3）弃上清，沉淀中加入1mL灭菌生理盐水，振荡混匀，13,000rpm离心10min，再重复洗涤一次；

（4）弃上清，沉淀中加入50μL 核酸提取液(内含固体沉淀颗粒物,为使颗粒均匀分布,每次取样时请用吸头反复吸打),振荡混匀15sec,100℃水浴或干浴10min然后12,000rpm 离心10min。取上清供PCR扩增用,或-20℃储存备用。

（5）阴性对照品、阳性对照品直接取出50μL，加入50μl核酸提取液，混匀后100℃水浴或干浴10min。12000rpm离心10min，备用。

2. 试剂配制【试剂准备区】

从试剂盒中取出TB反应混合液在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算所需反应试剂人份数n[n=样本数+对照数（2）]，每人份反应体系配制如下：

组分TB反应混合液 Taq酶 总体积

体积35.6μL0.4μL36μL

按n人份计算上述各试剂的用量，加入一适当容积的离心管中，混匀。按36μl量分装到PCR薄壁管中，然后转移到样本处理区。

3. 加样【样本处理区】

单个反应总体积为40μL，因此往上述分装有36μL反应液的PCR薄壁管中按顺序分别加入4μL的阳性对照品、4μL阴性对照品、4μL样品处理上清液，盖紧反应管，转移至PCR检测区。

4. PCR扩增及荧光检测【PCR检测区】

将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行PCR扩增：

步骤循环数温度时间

1 1 95℃3min

2 40 94℃15sec

60℃30sec 检测荧光选择：请选择FAM荧光.

1150817803【检验结果的解释】

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阳性对照CT值应小于38，阴性对照CT无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的S型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

1.检测样本CT值无数据时，报告为阴性。

2.检测样本CT≤38.0者判为阳性。

3.检测样本CT＞38.0为实验灰区，需要重复实验一次，取该样本核酸提取上清液4μL

加入配置好的反应液进行再一次检测，重做结果该样本CT值<40者为阳性，否则为阴

性。

【检验方法的局限性】

检测结果不能直接作为临床确诊或排除病例的依据，仅供临床医生参考使用。

【产品性能指标】

1.灵敏度: 本试剂盒的产品最低检出限为500copies/mL。

2.特异性: 本试剂盒与呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、链球菌、肺炎支原体（MP）、

肺炎衣原体（CP）、葡萄球菌以及沙门杆菌等主要的呼吸道病原体样本无交叉反应。

3.精密度：一份弱阳性的标本连续重复10次检测，其CT值的CV值小于10％。

4.抗干扰性：含有血红蛋白的临床样本对本试剂盒不会产生任何的干扰。

5.境内临床研究以深圳匹基生物工程有限公司生产的结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒

（PCR-荧光探针法）作为对照，共检测痰液标本567份，结果显示阳性符合率为99.62％，阴性符合率为97.70％，总符合率为98.59％。

【注意事项】

1.有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管

理规范执行。

2.本试剂盒仅用于体外检测。

3.实验室严格分区操作：

第一区：试剂准备区-准备扩增所需试剂

第二区：样本处理区-待检测样本和对照品的处理

第三区：PCR检测区-PCR扩增检测

4.各区物品均为专用，不得交换使用，避免污染，每次实验完后立即清洁工作台。

5.使用不含荧光物质的一次性手套、一次性专用离心管、自卸式移液和带滤芯吸头。

6.反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄

露污染仪器

7.加样时应使样品完全加入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

8.扩增完毕请立即取出反应管，密闭在专用塑料袋中，放于指定地点，等待统一处理。

9.实验中用过的吸头请直接打入盛有1%的次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭

菌后丢弃。

10.工作台及各种实验用品应定期用1%的次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。

11.PCR反应混合液应避光低温保存。

12.不同批号的试剂请勿混用，并请在有效期范围内使用。

【参考文献】

1. 《体外诊断试剂说明书编写指导原则》

2. 《临床实验室定量测定室内质量控制指南》

3. 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》

4. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6:986–994.

5. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reaction. Bio/Technology11:1026–1030.

6. Williams JF. Optimization strategies for the polymerase chain reaction. Biotechniques 19, 7:762-768.

【生产企业】

企业名称：艾康生物技术（杭州）有限公司

住 所：杭州市西湖区振中路210号

生产地址：杭州市西湖区振中路210号

邮政编码：310030

电话：400-118-2266

网址：www.aconlabs.com.cn

【医疗器械生产企业许可证编号】浙食药监械生产许20120007号

【医疗器械注册证书编号】国食药监械（准）字2013第3400159号

【产品标准编号】YZB/国 6385-2012

【说明书批准及修改日期】

批准日期：2013.02.01

修改日期：2016.03.10

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