天然抗氧化肽的研究进展(第三稿)

专业班级:制药1112班

学生姓名:赵子龙

学号:201103041169指导老师:肖怀秋

湖南·株洲

2013年12月15日

1摘要

目前使用的抗氧化剂大多是化学合成物如BHA、BHT，虽抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺有害，具有蓄积性致癌作用。因此，人们逐渐把目光转向天然抗氧化剂，如抗坏血酸、生育酚、胡萝卜素、儿茶精类等，某些蛋白质也具抗氧化活性，蛋白质长链中某些肽类具极强抗氧化活性，其抗氧化活性往往强于蛋白质和氨基酸。生物体内天然抗氧化肽主要为含量很低的肌肽和谷胱甘肽。蛋白酶水解产物中存在多种抗氧化肽，它们具较强抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功能。本文综述了制备天然抗氧化肽的研究进展，包括抗氧化肽产生、分离纯化、活性测定、作用机制、发展前景等。

关键词：天然抗氧化剂天然抗氧化肽抗氧化Abstract

Currently using antioxidants are mostly chemical compositions such as BHA butylated hydroxytoluene antioxidant effect is good but is harmful to the human liver spleen lung have effect of chemicals that cause cancer.Therefore people gradually turn their eyes to the natural antioxidants such as ascorbic acid tocopherol carotene catechu extract etc.some proteins and antioxidant activity and protein in the long chain some peptide has the very strong antioxidant activity its antioxidant activity often stronger than the protein and amino acids. Organism natural antioxidant peptide mainly content is very low carnosine and glutathione.Protease hydrolysis product of a variety of antioxidant peptides they have strong inhibition of biological macromolecules and peroxide remove free radicals in the body of the function.This paper summarizes the research progress of the preparation of natural antioxidant peptides including antioxidant peptides isolation purification activity determination mechanism of action etc.

Keywords:natural antioxidants，natural antioxidant peptides.目录

1、前言 (1)

2.天然抗氧化肽的作用机制 (1)

2.1.天然抗氧化剂的简介 (1)

2.2天然抗氧化剂的作用机制 (1)

2.3协同作用 (2)

3.天然抗氧化肽的提取 (2)

3.1从花生壳中提取天然抗氧成分 (2)

3.2从大豆中提取抗氧化肽 (2)

3.3从禽蛋中提取抗氧化肽 (2)

3.3.1全卵清源抗氧化肽 (3)

3.3.2卵白蛋白源抗氧化肽 (4)

3.4乳清肽的生产 (5)

3.5谷胱甘肽的生产 (5)

3.6肌肽的生产 (5)

4.天然抗氧化肽的分离 (6)

4.1酶解物RP-HPLC分离纯化 (6)

4.2高效液相色谱（HPLC）检测 (6)

4.4凝胶柱层析技术 (7)

4.5膜技术 (7)

4.6高速逆流色谱制备技术 (7)

5.天然抗氧化肽的活性 (8)5.1影响抗抗氧化活性因素 (8)

5.1.1水解条件 (8)

5.1.2pH值 (8)

5.1.3增效作用 (8)

5.2抗氧化活性的评估 (9)

5.2.1光化学发光法 (9)

5.2.2抗氧化剂还原铁能力法 (9)

5.3.3β-胡萝卜素亚油酸模型系统 (9)

5.3天然抗氧化肽活性测定实例 (10)

5.3.1花生壳中抗氧肽活性测定 (10)

5.3.2大豆肽抗氧化性能 (10)

5.4蛋源性抗氧化肽的活性构效关系 (11)

6.天然抗氧化肽存在的问题和展望 (12)

6.1目前开发抗氧化活性肽面临的问题 (12)

6.2天然抗氧化肽前景展望 (12)

参考文献 (13)

致谢 (1)1、前言

抗氧化物质广泛存在于植物、动物。食品中，由于其羟基取代的高反应性和强的吞噬自由基能力，故具有很好的抗氧化活性而被用作抗氧化剂。但目前用于油脂及油脂食品工业的抗氧化剂BHA（丁基羟基茴香醚）和BHT（二丁基羟基甲苯）都是人工合成的抗氧化剂。经科学家研究发现，BHA和BHT能够抑制人体的呼吸酶活性，使用过量可致畸、致癌。目前许多国家开始禁止使用合成的抗氧化剂。因此，开发无毒、安全的天然抗氧化剂已迫在眉睫[1]。

食品组分氧化往往导致食品品质劣化人们所关心的脂肪更是如此。脂肪氧化尤其是自动氧化严重危害食品质和安全一方面。脂肪氧化导致食品在感观特性上不能被人们所接受，另一方面脂肪氧化产物往往具有很强生理毒性危害人体健康。因此，在食品工业领域内非常需要一种既高效又安全的抗氧化剂解决生产中氧化问题不仅如此在医学、保健品和化妆品等领域也都不断产生对这类抗氧化剂的急切需求。

随着营养学和生物技术的发展人们发现介于蛋白质和氨基酸间的肽类与其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白质等相比较在食用方面安全性更高且具有极强的活性和多样性，其抗氧化性较蛋白质和氨基酸更为显著。人们对小分子肽生理功能认识的深人利用生物技术生产抗氧化肽的研究引起了相关领域科技工作者的广泛关注并取得了一定的成果。目前虽在食品工业中已广泛使用大量抗氧化剂但绝大多数属人工合成物，随着人们越来越关注食品安全和合成抗氧化剂安全问题，天然抗氧化肽是最近被广泛研究一类天然活性肽，由于它们具有较强抗氧化活性和很高安全性，因此在食品等领域己展现出极好应用前景。

2.天然抗氧化肽的作用机制

2.1.天然抗氧化剂的简介

天然抗氧化剂是指从天然动、植物体或其代谢物中提取出来的具有抗氧化活[1]。和人工合成抗氧化剂相比，它们具有天然、高效、低毒等优点。研究开发广谱、高效、安全的天然抗氧化剂，已成为当今食品添加剂研究领域中的热点之一。一些研究表明，某些复合抗氧化剂的抗氧化活性高于各组分在添加浓度下的活性之和[2]，许多研究也发现，多种抗氧化剂联合使用，其效果往往要大于使用同剂量的单一抗氧化剂的效果[3]。即单一活性成分的抗氧化作用往往弱于混合物，抗氧化成分之间常具有抗氧化协同作用，且协同作用受抗氧化剂的浓度、反应体系等影响。因此研究抗氧化剂之间的协同增效作用，寻找高效、低毒的复合型天然抗氧化剂对于高效利用抗氧化剂具有重要意义[4]。

2.2天然抗氧化剂的作用机制

这是天然抗氧化剂（NA H）抑制氧化的主要作用机制其断链反应模式为:ROO+ NAHROOH+NA RH+NAR+NAH有效的抗氧化剂必须具有较大的K N AH K N A比值。活性氧猝灭剂生物碱可通过与O2碰撞本身获得能量而使O2失活转变O2。叔胺在清除

1

O2时去甲基并伴随有甲醛和仲胺生成。作用于与自由基有关的酶天然抗氧化剂在体内的抗氧化作用可经此途径实现。络合促氧化的过渡金属离子实验证实芦丁、黄酮、磷脂和肽的抗氧化活性与其络合铁等金属离子的能力有关。增效作用有些天然抗氧化剂除本身可直接作用于氧化过程外还可与其他高效抗氧化剂交换电子再生高效维持一定水平。如维生素C、5-羟色胺、5-羟吲哚等。

2.3协同作用

某些在纯净状态下有微弱抗氧化活性的然物在混合状态下可表现较强的抗氧化活性。如几种氨基酸与酚类化合物配合黄酮、维生素E与复合磷脂配合均能显著增强抗氧化作用[1]。

3.天然抗氧化肽的提取

3.1从花生壳中提取天然抗氧成分

我国每年花生英果产量约50万t其中花生壳占140万t。这些花生壳常作为燃料或废渣而弃去。花生壳中除了含较多的碳水化合物及粗纤维外还含有少量的多酚类物质。据报道成熟的花生壳中有含量（质量含量，下同）为3.34%~7.13%的多酚类物质。酚类物质是油脂的抗氧化剂若花生壳中酚类物质超过0.167%时就显出抗氧化作用。因此，若把花生壳中的多酚类物质提出，即可获得天然的食品抗氧化剂。一直沿用的食品抗氧化剂多是化学合成物质如23-丁基-4-轻基菌香醚（BHA）、二丁基轻基甲苯（BHT）等[5]。称取5g花生壳粉于锥形瓶中加入溶剂50mL振摇下提取24h后过滤。滤渣再用溶剂提取过滤合并滤液进行减压蒸馏得淡黄色糊状物，然后真空干燥得成品1.25g[5]。

3.2从大豆中提取抗氧化肽

大豆肽是大豆蛋白经过酶水解得到一系列小肽大豆肽溶液经浓缩冷冻干燥后经氨基酸组成分析其氮基酸组成与大豆分离蛋白基本相同通常以大豆分离蛋白为原料使用中性蛋白酶As l.398或碱性蛋白醉2709进行水解物分别得到分子量为10000以下和2000以上多肽一般而言物质还原能力与抗氧化能力呈正比通过测定大豆肽还原能力发现，随着浓度增加大豆肽还原能力也随之增加，这表明大豆肽抗氧化性与其浓度有关[6]。

3.3从禽蛋中提取抗氧化肽

近年来，人们通过酶解禽蛋已获得多种抗氧化肽，主要来源于全卵清、卵白蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶和蛋黄蛋白质。这些抗氧化肽具有活性强、分子质量小、易吸收等特点。其中有多个抗氧化肽已确定氨基酸序列。具体见表1。

表1酶解禽蛋获得的抗氧化肽

Table1Antioxidant peptides by hydrolyzing eggs

来源消化酶氨基酸序列

鸵鸟蛋蛋清胃蛋白酶LTEQESGVPVMK鸡蛋清木瓜蛋白酶YLGAK

鸡蛋清木瓜蛋白酶GGLEPINFQ

卵白蛋白胃蛋白酶YAEERYPIL

卵白蛋白胃蛋白酶SALAM

卵白蛋白胃蛋白酶YQIGL

卵白蛋白胃蛋白酶YRGGLEPINF

卵白蛋白胃蛋白酶PEY

卵白蛋白胃蛋白酶LPDE

卵白蛋白胃蛋白酶WVE

溶菌酶木瓜蛋白酶/胰蛋白酶NTDGSTDYGILQINSR

鸡蛋黄碱性蛋白酶LMSYMWSTSM

鸡蛋黄碱性蛋白酶LELHKLRSSHWFSRR 3.3.1全卵清源抗氧化肽

卵清，即蛋清、蛋白，约占整个蛋质量的60%左右，水和蛋白质是其主要成分，在蛋清蛋白中含量最多的是卵白蛋白，其次是卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶。卵清源抗氧化肽有以全蛋清为原料制备的，也有来源于蛋清中纯卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的抗氧化肽。Hamid等[7]用胃蛋白酶酶解鸵鸟蛋蛋清获得LTEQESGVPVMK，该多肽具有较强的抗氧化活性，20µg/mL时，亚油酸自氧化抑制率为86.4%，200µg/mL时，DPPH的清除率达到81%，90.9µg/mL时，ABTS清除率为37.6%。Hamid认为其抗氧化活性可能是由其N-末端的Leu和C-末端的Lys起主要作用，有研究[8]认为C-或N-末端的疏水性Leu能够促进多肽与脂肪酸之间的相互作用，进而起到抗氧化作用。Chen等[9]用不同的酶酶解鸡蛋蛋清，发现水解产物的抗氧化性受水解时间和酶的类型影响，其中用木瓜蛋白酶酶解3h得到的水解产物的DPPH自由基的清除能力最强。通过RP-HPLC对水解物分离纯化，经LC-MS/MS测序得到两个多肽，分别为：Tyr-Leu-Gly-Ala-Lys

（551.54u）、Gly-Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe-Gln（974.55u），通过化学合成这2个多肽，发现二者对DPPH自由基的清除能力分别为粗蛋清水解液的7.48倍和6.02倍，这些结果提示由木瓜蛋白酶酶解鸡蛋清得到的水解液或多肽或许可用于食品加工和功能食品的开发。Chen等[10]分别用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味酶酶解鸭蛋蛋清，发现由木瓜蛋白酶酶解的鸭蛋清获得的多肽含量最高，并且其含量随着酶与底物浓度比例（E/S）的增加而增加，这表明鸭蛋清的水解度随着木瓜蛋白酶的增加而提高，通过Tricine-SDS-PAGE也证明了这一点，此外，通过SDS-PAGE还证实了，木瓜蛋白酶是所用的这几种酶中唯一能够使鸭蛋清蛋白水解的酶。对木瓜蛋白酶酶解的鸭蛋清多肽进行抗氧化活性分析，发现其对亚油酸氧化体系和超氧阴离子的抑制能力高于70%，对Fe2+的螯合能力高于90%。由此可见，木瓜蛋白酶酶解鸭蛋蛋清获得的肽有较强的抗氧化能力，这可能与蛋白酶具有较强的水解专一性有关。Lin等[11]用碱性蛋白酶酶解蛋清蛋白粉，探讨样品分子质量对还原能力的影响以及经高强度脉冲电场处理后的样品的还原能力。结果发现其碱性蛋白酶水解液具有较强的还原能力，特别是经1ku超滤膜截留后的样品，其还原能力更强，用高强度脉冲电场对分子质量小于1ku的样品进行处理6h，发现该样品的还原能力呈先升高后下降的趋势，处理4h时，其样品的还原能力最强。用高效液相色谱分析经高强度脉冲电场处理4h后的水解样品，明确证实了高强度脉冲导致部分大分子质量的多肽降解成了小分子肽，Perez等[12]认为高强度脉冲可能会导致多肽分子两极分化，破坏分子间的非共价键如疏水作用、静电作用、氢键，分离出更多的亚基，导致蛋白质结构紊乱，这可能是促使小分子肽表现出更好的生物活性的原因[13]。Manso等[14]给患有自发性高血压的小鼠按每天0.5g/kg的剂量长期喂食由胃蛋白酶酶解的鸡蛋清水解物，通过研究小鼠的抗氧化能力和血脂发现，患有自发性高血压的小鼠的血浆的抗氧化能力逐渐增强，主动脉中的丙二酮的浓度逐渐减少。这一结果表明鸡蛋清的胃蛋白酶水解物在患有自发性高血压的小鼠的抗氧化防御系统中起着重要作用，同时在不改变高密度脂蛋白水平的情况下，对降低甘油三酯和胆固醇具有有益效果。Manso认为鸡蛋清的胃蛋白酶水解物可能有利于改善由代谢紊乱引起的一些疾病如高血压、氧化应激、高血脂等。用酶酶解全卵清，其抗氧化活性增强，这意味着全卵清中具有抗氧化多肽，然而，采用不同的酶作用，得到的酶解产物对于不同的抗氧化指标表现出的抗氧化活性不同，这可能与酶具有较强的专一性有关。不同的酶具有不同的酶切位点，其酶解产物表现出的抗氧化活性不同，因此，在酶解制备抗氧化肽时，酶的筛选以及抗氧化指标的选择对后续制备高活性的抗氧化肽至关重要。3.3.2卵白蛋白源抗氧化肽

DAVALOS等[15]用胃蛋白酶酶解蛋清获得4个抗氧化肽

Tyr–Ala–Glu–Glu–Arg–Tyr–Pro–Ile–Leu，Ser–Ala–Leu–Ala–Met，

Tyr–Gln–Ile–Gly–Leu，Tyr–Arg–Gly–Gly–Leu–Glu–Pro–Ile–Asn–Phe，这4个抗氧化肽序列均包含于卵白蛋白序列中。分析这4个多肽的抗氧化活性，其氧自由基荧光吸收值（ORAC-FL）分别为3.809、2.659、1.718、1.184µmol TE/mg多肽，其中Tyr–Ala–Glu–Glu–Arg–Tyr–Pro–Ile–Leu的ORAC-FL值是α-生育酚

（0.µmol TE/mg多肽）的6倍多，因此，可以认为该多肽是一种强抗氧化剂。徐明生[16]用胃蛋白酶酶解鸡卵白蛋白，获得3个抗氧化活性多肽Pro-Glu-Tyr（分子质量

408.14u）、Leu-Pro-Asp-Glu（分子质量473.19u）、Trp-Val-Glu（分子质量433.18u）。考察了酶解提取物的超氧阴离子、羟基自由基的清除能力，以及亚麻酸氧化体系，水解产物浓度达5mg/mL时，超氧阴离子和羟基自由基的清除率分别为45%和56%，对亚油酸的抑制率等0.2mg/mL VE的抑制率。通过经D-半乳糖复制衰老小鼠模型的体内抗氧化实验发现，给衰老小鼠喂食高、中剂量的水解提取物后，能够极显著

（p<0.01）的抑制小鼠血清和肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、氢化酶（CAT）的下降，同时能够极显著（p<0.01）降低衰老小鼠血清和肝脏中的丙二醛（MDA）含量，这说明由卵蛋白酶解制备的抗氧化肽能够有效起到抗氧化的作用[17]。

3.4乳清肽的生产

Ramos等用四种商业酶（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）和三

种粗蛋白酶（A-地衣芽抱杆菌内源酶、B-芽抱杆菌蛋白酶、C-曲霉内源酶和外肤酶）水解乳清分离蛋白得到水解度在4%一37%范围内乳清蛋白水解肽，其中粗蛋白酶F在50℃作用6h（乳清蛋白溶液经90℃预热）得到水解度最高乳清蛋白酶。经胃蛋白酶水解得到乳清蛋白肽，不仅没有抗氧化性反而表现出轻微促氧化作用；另外三种商业酶水解得到乳

清蛋白肤则没有表现出明显抗氧化性。而使用三种粗蛋白酶水解得到乳清蛋白肽能够表现一定抗氧化性其中粗蛋白酶F水解lh得到产物具有最强抗氧化性可抑制40%TBARS产生；

PG可抑制85%TBARS产生[6]。

3.5谷胱甘肽的生产

NH CH

COOH CH C

O

NH CH

CH

SH

C

O

NH CH COOH

CH

图2谷胱甘肽分子结构式

1555年oereyPailhade首次从酵母中分离出天然型谷胧甘肽（GSH）1921年Hopkin s第一次制备GSH结晶1929年Pirie和Pinher通过对该三肽生理化学研究得出GSH正确结构式（图2）1935年首次人工合成GSH。谷脱甘肽是一种含巯基三肤广泛分布于动植物细胞、谷物和油料种子中具有多方面生理功能，在机体生化防御体系中起着非常重要作用。其在机体中抗氧化作用主要表现为:（l）谷胱甘肽是体内自由基清除剂它能与许多自由基（烷自由基、过氧自由基、半醒自由基）作用。（2）谷胱甘肽主要功能是保护红细胞免受外源性和内源性氧化剂损害除去氧化剂毒性。（3）谷胱甘肽能清除脂过氧化物[6]。

3.6肌肽的生产

1900年在首次发现肌肽它是一种水溶性天然二肽由p一丙氨酸和L一组氮酸结合成p~Ala-His形式（见图1）。肌肽广泛存在于动物的骨骼肌中（猪肌肉含

2800mg/kg）此外在大脑、心肌、肾脏、胃、晶状体内也有少量分布。实验室通常从肌肉组织中提取肌肽但成本过高缺乏批量生产意义。国外正在研究从肉品屠宰下脚料中提取以获得廉价而大量肌肽。

HC C N NH

CH CH

2

COOH

CH

NH CO CH

2

NH

2

图3肌肽分子结构

在大量实验研究中发现肌肽具有抗氧化、增强免疫、调节酶活力、pH缓冲和神经传导等生理功能其中抗氧化活性主要表现在:（l）具有自由基缓冲作用能直接捕获活性氧成分和自由基；（2）鳌合金属离子；（3）抑制血红蛋白催化脂质氧化；（4）抑制光激活的核黄素催化脂质氧化；（5）抑制脂肪氧合酶催化脂质氧化；（6）保护过氧化物歧化酶；（7）可直接与脂肪氧化产物一醛类物质结合从而保护食品中其它组分如蛋白质免于氧化这些作用也称为保持细胞稳态作用。添加不同浓度（0.5%、1.5%）肌肽于纹碎猪肉中经过一定储藏期测样品TBAR S值。结果发现添加0.5%肌肽即可有效抑制加盐纹碎猪肉氧化作用；添加1.5%肌肽具有比添加0.5%STP（三聚磷酸钠）、0.02%以一生育酚0.02%BHT 更好抗氧化效果。且肌肽在颜色与风味上评分也较其它抗氧化剂高具有稳定颜色效果。研究人员认为肌肽作为供氢体使肌红蛋白上血红素铁保持二价从而抑制高铁肌红蛋白形成；也可能是由于肌肽清除自由基因自由基也会直接引起肌红蛋白氧化。尽管脂溶性自由基清除剂能抑制肌红蛋白氧化但它钝化水溶性自由基能力低于肌肽，所以肌肽能更好稳定肉的颜色[6]。

4.天然抗氧化肽的分离

4.1酶解物RP-HPLC分离纯化

经离子交换分离获得的抗氧化活性强的组分脱盐，冻干粉用超纯水溶解，上反相高效液相分离纯化。分件为:C18（Symmtry4.6mm×150mm），上样25µL用含0.1%三氟乙酸的乙腈梯度（0%-70%）洗脱详细条件见表1，采用紫外检测器在215nm处检测。分别收集各主要峰，冻干，测定抗氧化活性，然后集中收集抗氧化活性峰数[18]。

表2RP-HPLC洗脱条件

Table2Elution parameters of RP-HPLC

时间/min流速/mL﹒min-1A/%B%

0.010.500.0100.0

26.000.5026.074.0

26.000.5070.030.0

31.000.500.0100.0

35.000.500.0100.0

4.2高效液相色谱（HPLC）检测

HPLC检测法是目前应用最广泛、最有效的分离分析技术之一，具有分辨率高、分析速度快、重复性好、定量分析精确度高等优点。用HPLC法对茶多酚进行了分离分析[19]，结果表明：HPLC能有效分离荼多酚和其组分EC、EGC、ECG和EGCG并精确定量，相对标准偏差小于5%；采用甲醇-水醋酸（三氟醋酸）作流动相，分别以等强度洗脱和梯度洗脱（均在30min内）分离测定了6种不同产地茶叶样品和3种茶多酚样品中7种儿茶素的含量[20]。

4.3吸附树脂法

吸附树脂法是使用硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺或大孔树脂等固态物质作吸附剂，用适当溶剂洗脱分离混合物，此工艺简单、操作方便、能耗低、操作条件温和，避免了有效成分失活，产品收率和纯度高，无毒、安全，而且可持续性生产，有利于大规模工业化生产。

4.4凝胶柱层析技术

该技术分离机理类似于分子筛，样品中大分子化合物不能进人凝胶颗粒内部，只能在颗粒间移动，阻力小，移动快，小分子化合物能自由扩散到凝胶内部，透过层析柱时阻力大，由此经过一段时间洗脱，混合物组分按大小而分离。无锡轻工大学研究所利用Sephadex LH-20层析分离，并结合制备型HPLC分离纯化，得到7种儿茶素的单体化合物，用UV、IR、NMR及MS等方法鉴定了其化学结构，7种儿茶素化合物的纯度均大于99%，总得率为66.7%，总回收率为82.1%。

4.5膜技术

膜技术是以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧组分存在推动力时，原料侧组分选择性地透过膜，从而达到分离的目的。应用于儿茶素分离的现处于初步阶段，主要是利用UF及NF对儿茶素的选择分离，主要利用超滤、微滤对蛋白质、可溶性多糖、胶质等大分子物质进行截取以及用反渗透，纳滤进行浓缩。近期，有研究报道以低档茶叶为原料，采用超滤膜-离子沉淀法成功地进行了高纯茶多酚的提取，纯度达99.%，收率达11.3%。4.6高速逆流色谱制备技术

HSCCC是一种较新型的液液分配技术，避免了使用固体吸附材料造成的样品不可逆吸附或降解等缺点。1982年由Yionchiro Ito首创，1994年将其改进，使HSCCC进样量加大，能使其分离克量级样品，其原理同逆流色谱技术一样。目前，该技术被广泛应用于天然药物成分的分离制备和中药的分析鉴定。中国农业科学院茶叶研究所利用双机高速逆流串联分离儿茶素混合物，分别得到纯度为81%EGCG、90%EC、87%ECG、75%EGC。析纯化；另一种是制得粗品后直接用制备HPLC法分离纯化（用丙酮和水洗脱）。方法一操作过程复杂，周期长，条件不易控制；方法二难以得到大量的多种高纯儿茶素，而且柱子总负载量巨大，制备效果不高，色谱柱容易污染，寿命短。把两种方法结合起来，将粗提品先经柱层析分离，再用制备HPLC纯化精制，使分离效应和产品纯度提高，分离周期短，所用的溶剂价格低廉，毒性小，易回收，精确度高[21]。

5.天然抗氧化肽的活性

5.1影响抗抗氧化活性因素

5.1.1水解条件

水解所用的酶对肽抗氧化性有明显影响。例如选择酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解实验,将三种蛋白酶水解产物加到模拟溶液体系和实物体系中,进行抗氧化能力比较。结果抗氧化性能顺序为酸性蛋白酶水解最高,胃蛋白酶水解物次之,中性蛋白酶解物最差。呈现这种差异原因可能是:（l）各种酶解反应条件各异，影响底物大豆蛋白构象变化；（2）各种酶的专一性促使产物多肽N-末端、C-末端氨基酸组成及排列各异,这是影响肤功能性质主要因素。有的研究人员比较中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶.蛋白酶和胰蛋白醉对大豆分离蛋白水解能力,水解能力最强的是碱性蛋白酶2709,其平均水解度接近30%,水解后产生大豆肽具有较强抗氧化能力[6]。

5.1.2pH值

据报道层析萃取液比未层析萃取液具有较好抗氧化效果推测其原因可能是层析组之非血红素铁与总铁含量较非层析组低磷酸盐含量较多且pH高（层析组6.32未层析组6.05）之缘故。尤其在较高p H环境下肌肽易带负电荷从而增强其整合金属离子能力,并增强其抗氧化性。另据报道肌肽抑制脂质氧化程度与pH值有关。pH为7.0-8.0时,生成TBARS 分别为pH S.0、pH6.0时2倍和3倍,这也许是因为血红蛋白催化脂质氧化在碱性pH值时最活跃。pH较高时,20mM肌肽对TBARS生成抑制程度较高,达70%-80%。当pH=6.0时,尽管生成TBARS最少,但对TBARS生成抑制程度也较低。pH低时,不论加多少肌肽铁仍能与脂质氧化,因在酸性环境下,铁离子始终维持二价状态。总之,当pH在7.0-8.0范围内,肌肽能有效抑制TBARS生成；当pH在5.1-7.0范围内,25mM肌肽对铁和Vc生成TBARS抑制率为70%-90%。另外,对过氧化氢激活的血红蛋白催化2004年第10期很食与油脂卵磷脂脂质体系而言,当pH范围在5.8-7.1之间时,肌肽对TBARS 生成抑制率为60%-10%。

5.1.3增效作用

抗氧化肽与某些酚类物质联合使用时,表现有抗氧化增效活性。作为肉制品中抗氧化剂,肌肽与Vc有协同效应,联合使用可延长货架期并保持肉制品色泽稳定。肌肽与vc均能抑制正铁肌红蛋白成,但Vc（0.1%）抑制效率高于肌肽（l%）；而当肌肽与Vc联合使用时,仰制效果强于单独使用肌肽和Vc。实验证明,过渡金属铜、等能催化Vc氧化,但将肌肽加入到此体系中,Vc被氧化的程度明显减少。据资料介绍,饲料中加入生育酚及宰后肉中加入肌肽，对贮存在冰箱中鸡效果,比单独使用二者之一效果好。对于加入盐,且经加工后在冰箱中贮存

鸡肉,研究结果类似,即肌肽与饲料中生育酚可使加盐纹碎鸡肉中脂肪和胆具有高稳定性。

综上所述,抗氧化肽具有良好抗氧化性和较高安全性,在食品工业中将有广阔应用前景。

在今后研究中,一方面需要深入研究不同抗氧化肽发挥作用使有明显的影响。列如选择性蛋

白酶、中性蛋白酶，用条件,以能尽早在工业生产得到应用；另一方面应逐步揭开抗氧化肽

分子结构与抗氧化性之间关系,以便寻找抗氧化性更强天然抗氧化肽。同时,在实际应用过程

中,还应注意与其它抗氧化剂之间增效作用,以最大限度发挥氧化肽作用[6]。

5.2抗氧化活性的评估

5.2.1光化学发光法

光化学发光（PCL）法是使用具有光化学激发作用的光敏剂（photoscnsitizer，发光

氨）激反应分子，使之在紫外灯的作用下以比正常条件下快1000倍的速度发生氧化反应，迅速生自由基。自由基与样品中的抗氧化剂发生反应后，用专门的检测仪器超快速抗氧化剂和自由全自动分析仪对剩余的自由基进行测定，从而检测出抗氧化剂的抗氧化能力该方法能够快速确直接全面地测定基质中的综合抗氧化能力Tsao等选取几种多酚类抗氧化剂以及

植物提取物作为研究对象，用PCL法检测了它们的抗氧化活性，研究结果发现，PCL法确实能够速准确地检测出抗氧化剂的抗氧化活性，并且能够通过信号图直观地看出几种物质之间抗氧活性的差异由于光化学发光法中所用到的分析仪器价格昂贵，在国内应用此法对抗氧化剂的研究鲜有报道。

5.2.2抗氧化剂还原铁能力法

它的原理是通过Fe3+-TPTZ（Fe3+-ferric tripyridyl-s-triazine）被样品中的还原物质还原为Fe2+-TPTZ的形式，该物质呈现出蓝色，并在593nm波长处有最大吸收峰吸收值越大，说明待测植物化学物的抗氧化活性越高郭长江等[3]通过FRAP法对36种蔬

菜和30种水果的抗氧化活性进行了测定比较。

5.3.3β-胡萝卜素亚油酸模型系统

β-CLAMS的原理是在高温条件下，亚油酸在氧化过程中会产生过氧化物及游离的自由基，这些过氧化物及游离的自由基会引起-胡萝卜素色（该物质在490nm波长中有最大吸收），通过测定加入的抗氧化剂对-胡萝卜素褪色的抑制情况，可判断出该抗氧化剂的抗氧化活性的强弱。CLAMS就是根据这个原理建立起来的一套评估抗氧化活性的模型系统洪庆慈等以油酸法测定了8种粮食材料提取物的抗化活性，他们的实验结果表明，大麦籽和燕麦籽的石油醚提取物都有较高的抗氧化活性，而壳和花生壳的石油醚提取物只有微小的抗氧化活性而8种粮食的甲醇提取物都具有一定的氧化活性，其中以花生壳稻壳和黄豆壳提取物的抗氧化活性比较强[22]。

5.3天然抗氧化肽活性测定实例

5.3.1花生壳中抗氧肽活性测定

将20g新炼制的猪油加到烧杯中分别加入花生壳的乙醇提取物。提取物在猪油中含量分别为0.30%和0.50%，然后在70℃恒温放置10d在这段时间内测定猪油的过氧化值，并与BHT作对比结果如图4所示。

图4花生壳的乙醇提取物对猪油抗氧化性能的影响

图4结果表明加入花生壳乙醇提取物的猪油抗氧化性得到提高其中含量为0.50%的猪油抗氧化能力较强。但与BHT对照效果尚差。主要是因为提取物为粗产物有效成分较低的缘故[5]。

5.3.2大豆肽抗氧化性能

大豆分离蛋白酸性状态下溶解性降低特别是在pH4.5（大豆球蛋白等电点）时，蛋白质基本上不溶解而沉淀。而蛋白水解后肽链变短功能性质发生明显改变大豆肽在较宽pH范围内仍保持良好溶解状态溶液保持透明。溶解性增强是因为其体积变小离子性增强端基极性

基团增加使溶解度增加。抗氧化剂抗氧化值越大其抗氧化作用越强。荣建华等通过实验测定发现大豆肽抗氧化值较高是维生素C的1.5倍表明大豆肽具有较强抗氧化作用。一般情况下样品还原能力越强其抗氧化能力也越强。根据大豆肽还原能力测定方法在70nm处测定吸光值越大则样品还原能力越强。大豆肽还原能力随其浓度增加而增大提示大豆肽抗氧化能力随浓度增加而增强。大豆肽对脂肪氧合酶活性具有明显抑制作用并呈t效关系。大豆肽在

0.1mg-50mg/m l浓度范围内对大豆脂肪氧合酶有明显抑制作用在低浓度0.1mg

-0.5mg/ml与高浓度250mg-500mg/mL下抑制率较高均大于90%而在中等浓度lmg-10mg/mL下抑制率较低均不到80%。在0.1mg-10mg/m l浓度范围内随大豆肽浓度增大大豆肽对脂肪氧合酶抑制作用逐渐减弱，当大豆肽浓度为10mg/m l时大豆肽对酶抑制率最低为0.2%；然后随浓度增大大豆肽对酶的抑制作用逐渐增大。大豆肽对大豆脂肪氧合酶活性抑制作用可能通过以下途径来实现:（l）络合酶活性部位有报道表明肽类物质和金属离子亲和力随组氨酸残基含量增加而增强。经检测大豆肽中组氨酸含量较高

为2.3%因此大豆肽能夺取脂肪氧合酶活性部位，从而能抑制其活性；（2）与底物竞争酶活性部位；（3）与酶分子之间相互作用而影响或改变酶的空间结构从而降低醉活性。在浓度为10mg/ml时大豆肽对脂肪氧合醉抑制率最低，可能是在此浓度时大豆肽与酶分子之间相互作用最弱，因而对脂肪氧合酶抑制率也最低[6]。

5.4蛋源性抗氧化肽的活性构效关系

大量研究发现，蛋白水解多肽的抗氧化生物活性主要与其结构、氨基酸序列组成、氨基酸特性或在溶液中的分散性有关[22]这些因素又受蛋白质来源和水解条件如消化酶、温度、水解时间以及酶和底物的比例等的影响[23]。一些特殊氨基酸残基在抗氧化肽的活性中起着主要作用，如Tyr、His、Leu等[24]，DAVALOS等[15]用胃蛋白酶酶解蛋清获得4个抗氧化肽，研究发现Tyr–Ala–Glu–Glu–Arg–Tyr–Pro–Ile–Leu、

Tyr–Gln–Ile–Gly–Leu、Tyr–Arg–Gly–Gly–Leu–Glu–Pro–Ile–Asn–Phe这3个多肽的抗氧活性可能主要由N-末端的Tyr残基决定，因为在测定的所有氨基酸单体中，Tyr的ORAC-FL值最高。Moosmann[25]也得出了这一结论，当去掉Tyr残基后，一些分泌肽激素就失去了其抗氧化活性。这可能是由于活性肽肽链中Tyr残基的酚环和吲哚结构充当氢供体，当给予自由基后，自身生成稳定的自由基中间体，因而这类多肽具有强抗氧化性[26]。为了证实Tyr在Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu强抗氧化活性中的作用，DAVALOS合成了Tyr-Pro-Ile-Leu和Tyr-Pro-Ile2个短片段，分析二者抗氧化活性发现，ORAC-FL值均低于Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu，但Tyr-Pro-Ile的ORAC-FL值高于Tyr-Pro-Ile-Leu，而Leu单体不具有抗氧化活性。

DAVALOS认为这能够表明Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu中的第二个Tyr具有重要作用。此外，Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu序列中含有2个酸性氨基酸，Suetsuna等[27]认为酸性氨基酸具有金属离子螯合作用，这或有助于其表现出强抗氧化活性。Park等[28]用碱性蛋白酶酶解脱卵磷脂的蛋

黄:Leu-Met-Ser-Tyr-Met-Trp-Ser-Thr-Ser-Met-

Leu-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Arg-Ser-Ser-His-Trp-Phe-Ser-Arg-Arg，其抗氧化活性与N-末端的Leu残基以及序列中的His残基有一定的关系。已证实N-末端的Leu残基具有抗氧化作用[29]，此外，抗氧化活性较强的有如下：

Leu-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Arg-Ser-Ser-His-Trp-Phe-Ser-Arg-Arg中还含有His残基，有研究[30]表明，含His残基的多肽具有抗氧化活性，这可能与His残基上的咪唑环的螯合作用以及对脂质原子团的捕获能力有关，但含有His残基的多肽的抗氧化活性要比His残基自身的抗氧化活性要高，这可能与多肽的疏水性增加有一定的关系[17]。6.天然抗氧化肽存在的问题和展望

6.1目前开发抗氧化活性肽面临的问题

国内外已开始进行在植物、动物水解蛋白的抗氧化肽方面的研究但是不同来源不同条件下的水解产物中抗氧化肽的结构、性质尚无展开全面深入研究。一方面自然界中许多动物、植物蛋白在适宜的作用条件下水解都能产生抗氧化肽这使得通过水解技术制备大量的天然抗氧化肽有了来源上的保障；但另一方面目前国内外水解蛋白产物中抗氧化肽的研究都处于实验室阶段抗氧化肽的功效研究多采用体外实验，如抑制脂质氧化、清除自由基（体外创造自由基产生体系如Fenton体系、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系、邻苯三酚自氧化体系等）、化学试剂方法（如铁-硫氰酸铵法）等，体内抗氧化性试验报道还刚刚开始。这些与酶解过程的复杂性、成本较高以及蛋白质、肽和氨基酸混合体系的复杂性引起的抗氧化肽分离纯化的困难有关[31]。

6.2天然抗氧化肽前景展望

随着生物工程技术（包括上游技术和下游技术）的发展多种不同来源、特性各异的商品蛋白酶出现酶成本的降低将使利用特定蛋白质资源进行性酶解生产各种生物活性肽成为可能。此外各种新型分离技术（等电点分离技术、离子交换树脂吸附分离技术、膜分离技术、亲和层析技术等）的相继产业化应用进一步使各种生物活性肽系列组分的分离纯化和富集成为可能[54]。因此尽管采用酶控制水解不同来源蛋白质的方法获取抗氧化活性肽还有很多未知方面需进一步进入研究相信在不久的将来蛋白质的性酶解技术将会是制备抗氧化肽的一种重要手段符合天然、营养、安全的抗氧化剂的发展潮流[31]。

近年发现的许多植物中的天然抗氧化剂尚需对其活性成分进行全面的结构鉴定并进行毒理学研究某些方面还有待于深入研究包括:（1）天然抗氧化物在食品中的作用进入生物体内本身及其代谢产物的生理功能。（2）天然抗氧化剂在生物体内的毒性或病理活性。（3）无毒、价廉、显效的天然抗氧化物的资源筛选、有效成分提取、分离技术、结构鉴定及功效关系研究。（4）如何运用生物技术、食品高新技术等从不同层次、不同途径实现己知天然抗氧化物的工业化生产等。然而我们还应该看到开发天然抗氧化剂广阔的应用前景。21世纪是一个抗氧化、抗衰老及追求食品安全与可持续发展的绿色世纪。以天然抗氧化剂取代化学合成抗氧化剂是今后工业发展的趋势开发实用、高效、成本低廉的天然抗氧化剂仍是研究的重点[4]。

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本篇论文是在肖老师的悉心指导下完成的。老师渊博的专业知识、严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严于律己、宽以待人的崇高风范，朴实无法、平易近人的人格魅力对本人影响深远。不仅使本人树立了远大的学习目标、掌握了基本的研究方法，还使本人明白了许多为人处事的道理。本次论文从选题到完成，每一步都是在肖老师的悉心指导下完成的，倾注了老师大量的心血。在此，谨向老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！在写论文的过程中，遇到了很多的问题，在老师的耐心指导下，问题都得以解决。所以在此，再次对老师道一声：老师，谢谢您！

时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。离校日期已日趋渐进，毕业论文的完成也随之进入了尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师、同学、团队的力量，在这里我们表示诚挚的谢意！在此我向湖南化工学校和制药专业的所有老师表示衷心的感谢，谢谢你们三年的辛勤栽培，谢谢你们在教学的同时更多的是传授我们做人的道理，谢谢三年里面你们孜孜不倦的教诲！

三年寒窗，所收获的不仅仅是愈加丰厚的知识，更重要的是在阅读、实践中所培养的思维方式、表达能力和广阔视野。很庆幸这三年来我遇到了如此多的良师益友，无论在学习上、生活上，还是工作上，都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在一个充满温馨的环境中度过三年的大学生活。感恩之情难以用言语量度，谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意。

最后要感谢的是我的父母，他们不仅培养了我对中国传统文化的浓厚的兴趣，让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助。在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望！我一定会好好孝敬他们，报答他们！爸妈，我爱你们！

“长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。”这是一句很激励人的话，马上就面临着找工作，希望我们班的所有同学都勇往直前，为人生做好准备。祝福老师工作顺利，母校光辉永存祝愿自己能够继续少年时的梦想，永不放弃。