苦马豆素分离进展

    吴旭锦1，杨鸣琦1*，白春黎2，周宏超1    

（1．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵 712100；

2．陕西省榆林农业学校，陕西榆林 719000）

摘要：苦马豆素是疯草的主要毒性成分,研究结果表明它具有明显的抗肿瘤活性。目前，苦马豆素作为一种崭新的抗癌药物倍受关注。苦马豆素的实验室分离技术已取得很大进展，已通过索氏抽提、柱层析、离子交换层析、高效液相色谱、萃取等方法分别从苦马豆属、棘豆属、黄芪属的多种植物及豆类丝核菌中分离出了苦马豆素。文章对苦马豆素的分离进行了综述。

关键词：苦马豆素 ； 分离

中图分类号：R284。11                             文献标识码：A                               文章编号：1007－5038（2005）

苦马豆素（Swainsonine,SW）即1,2,8-三羟基-八氢吲哚兹定生物碱（1,2,8-trihydroxyoctahydroindolizine），是引起动物疯草中毒的主要化学成分。1979年，澳大利亚学者Colegate[1]首先从灰苦马豆（Swainsona canescens ）中分离到SW。随后，美国学者Molyneux[2]从斑荚黄芪中分离到SW。中国学者曹光荣等[3]从黄花棘豆、黄有德等[4]从变异黄芪、赵宝玉等[5]从茎直黄芪、童德文等[6，17]从甘肃棘豆、李勤凡等[7]从冰川棘豆中分离到SW。尤其值得关注的是美国学者Schneider[8]、Broquist[9]及杨鸣琦等[10]还分别从豆类丝核菌（Rhizoctonia leguminicola）中分离到SW。

SW的出现引起了植物学、毒理学、病理学、化学、生物化学、免疫学和医学界的极大兴趣。现已证明SW作为免疫调节剂、肿瘤转移及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用[11,12]，其作为一种崭新的抗癌药物更有着极其诱人的开发前景，引起了世界各国的极大重视。一旦SW的分离技术成熟，毫无疑问将是癌症患者的一大福音。

但是目前已知的SW来源有限，分离效率不高，实验室分离技术尚需进一步完善。因此，寻求有效的分离途径成为目前的热点和关键。

1. 苦马豆素的来源

1.1 来源于植物

.   目前知道含SW的植物主要是豆科黄芪属和棘豆属(统称为疯草)，其次是苦马豆属。由于世界各国尚未对此类植物进行系统的分类研究，所以究竟有多少种植物含SW，现在尚不清楚。

1.2来源于豆类丝核菌

豆类丝核菌（Rhizoctonia leguminicola）属真菌门（Fungi）半知菌类（Fungi Imperfecti）无孢菌群（Mycelia sterlia）丝核菌属（Rhizoctonia）[13] ，  Schneider和Broquist分别从美国标准菌库保存的豆类丝核菌中分离到SW[8,9]。国内杨鸣琦等首次自行分离到10株豆类丝核菌，并从中提取出SW，且测定到其自然干燥菌丝体中SW含量为1.23%～2.99%[12]，远高于植物中的含量。因此，从豆类丝核菌中分离SW前景广阔，很可能成为以后SW批量生产的方向。

1.3人工合成

美国化学家Yasuda、Bennett等先后人工合成了SW。随后加拿大Toronto化学研究所也有了合成产品。我国科学院院士周维善 [14]人工合成苦马豆素也获成功，但产率很低。目前无论是提取及人工合成产品都比较昂贵,每毫克价格为202美元。

2．苦马豆素的分离

2.1 从植物中分离

2.1.1 从苦马豆属植物中分离

SW的首次成功分离是由澳大利亚学者Colegate[1]完成的。他利用甘露糖苷酶作为工具从苦马豆属植物灰苦马豆中分离出甘露糖苷酶抑制剂——吲哚兹定生物碱——SW，从而确定了灰苦

马豆的有毒成分为SW，这是一个极有意义的进展。他报道的方法是：用热乙酸乙酯索氏提取24h，水溶部分上强酸性阳离子交换柱，收集稀氨水洗脱部分，浓缩后的残留物上药用琼脂糖凝胶CL-6B，用氯化钠梯度洗脱，产物用氨性氯仿提取，回收溶剂后用氯仿/乙醚结晶和重结晶，得到白色针状晶体，即SW。

2.1.2 从棘豆属植物中分离

（1）从黄花棘豆中分离 。 中国学者曹光荣等[3]首次从黄花棘豆中分离出SW，并证实SW对血浆α-甘露糖甙酶有强烈的抑制作用[3,15]。他报道的方法是：将黄花棘豆干草粉用酸水浸泡2次，每次12 h，酸滤液过阳离子交换柱，倾出树脂，用去离子水洗至中性，晾干后用体积分数10 %氨水调节pH 9～10，然后上柱，先用氯仿后用丙酮洗脱，浓缩丙酮洗脱液的总生物碱。总生物碱经硅胶柱层析，用氯仿、丙酮、体积分数17 %氨水体积比为82.5:15.5:2洗脱，每5 mL收集1份，薄层色谱（TLC）结合α-甘露糖苷酶活性抑制试验结果，合并同类并浓缩，分离出SW单体。

（2）从甘肃棘豆中分离 。 丁伯良等[16]采用GC-MS联用仪从甘肃棘豆中检出SW，但并未分离到SW。童德文等[6] 从甘肃棘豆中分离到SW。他的报道的方法是：将甘肃棘豆干草粉用甲醇浸泡3次，每次24h，合并甲醇液，70 ℃减压浓缩至浸膏，1 mol/L HCL溶解后过滤，滤液上732型强酸性阳离子交换树脂，先用去离子水洗脱，弃去洗脱液，后用1 mol/L NH4OH洗脱，收集洗脱液，并挥发至干，即得总生物碱。将总生物碱用甲醇反复溶解，过滤，挥干滤液后用氨性氯仿溶解，回收氯仿，残留物与60～325 µɡ硅胶研磨均匀后上硅胶柱（180 µɡ），氯仿、甲醇、氨水、水体积比为70:26:2:2混合溶剂洗脱，每10 mL收集一管，TLC结合α-甘露糖苷酶活性抑制试验结果，合并同类部分，挥干后在90 ℃，－0.094 Pa真空条件下升华，得 SW单体。之后，童德文等[17]采用高效液相色谱（HPLC）亦从甘肃棘豆中分离出SW。前处理与以上报道的方法同，得到总生物碱后上高效液相色谱柱，色谱条件：反相（C18硅胶柱），用水和甲醇混和液洗脱，在25 min内有5 %～100 %甲醇线性梯度洗脱，SW一般出现在80 %～100 %范围内，表现一个宽峰。收集该部分洗脱液，挥干后氯仿重结晶得到白色针状结晶，即为SW。

李勤凡等[18]也从甘肃棘豆中分离到SW。他报道的方法是：将甘肃棘豆干草粉浸泡于水中，75 ℃超声波振荡2次,3000  r/min离心，水提取液煮沸浓缩，过滤，用正丁醇萃取，弃去水溶液部分，正丁醇部分加入0.2 mol/L稀硫酸调pH至中性，挥干水分，制成浸膏,将浸膏与二氧化硅粉末搅拌，蒸干研碎，加入氨水调pH 10，挥干后氯仿提取杂质，再用无水氨性氯仿提取，提取液挥干，100 ℃先常压后减压升华，得白色针状晶体，即为SW。 

(3) 从冰川棘豆中分离 。 李勤凡等[7]从冰川棘豆中分离到SW。他报道的方法是：将冰川棘豆干草粉经甲醇提取，1 mol/L盐酸酸化，酸水液用氯仿萃取数次,氢氧化钠调pH 9～10，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。将正丁醇部分经硅胶柱层析，乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，每30～50 mL收集一份，TLC监测，同类合并。Ehrlich’s试剂显色明显段用氨性氯仿处理，油浴升华，得到白色针状结晶，与苦马豆素标准样品进行TLC对照，其Rf值相近，点的形状、颜色相同，气相色谱检验，其出峰时间与苦马豆素标准样一致，初步确定所得白色针状结晶为SW。

（4）从小花棘豆中分离 。 葛鹏斌等[19]从小花棘豆中分离到SW。他报道的方法是：将小花棘豆干草粉用工业甲醇热回流4次，每次4 h，提取液回收溶剂，制成浸膏，用1 mol/L盐酸溶解，过滤，弃去滤渣，酸水液用氢氧化钠调pH 9～10，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，TLC检查发现SW存在于乙酸乙酯和正丁醇部分，且正丁醇部分含量高，氯仿部分未检出。正丁醇部分经硅胶柱层析分离,氯仿:甲醇:氨水:水体积比为70:26:2:2混合溶液梯度洗脱,分段收集，TLC检查,得到6个成分段,其中65～84份为浅黄色粉，Ehrlich’s试剂显色呈紫色，经梯度升华得到一种白色针状结晶，鉴定为SW。

2.1.3 从黄芪属植物中分离

（1）从变异黄芪中分离 。 黄有德等[4]从变异黄芪中分离到SW。他报道的方法是：将变异黄芪干草粉碎为约40目粗粉，用1 %盐酸浸渍24 h，渗漉，渗漉液通过732型阳离子交换树脂，待酸漉液全部通过树脂后，将树脂晾干，用氨水碱化调至pH 9～10，然后装索氏提取器，用乙醚洗脱72 h，再回收乙醚得粗提物总生物碱，粗提物装柱，在100目硅胶柱中于105 ℃温控下活化4 h，用氯仿：丙酮：甲醇液（85：10：5）洗脱，得粗结晶，再用氯仿重结晶，即得到SW结晶（mp144~145 ℃）。

陈绍淑等[20]也从变异黄芪中分离到SW。她报道的方法是：称取变异黄芪干草粉4 kg，用甲醇热回流提取5次，每次4 h，合并甲醇液，70 ℃减压浓缩成浸膏，1 mol/L盐酸溶解后过滤，得酸水液，用氯仿萃取，除去色素等杂质，然后用氢氧化钠调水相pH 9～11,再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复萃取多次，回收溶剂分别得氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分。TLC检查，SW主要存在于正丁醇部分。将正丁醇部分生物碱进行分离纯化，准确称取10 g变异黄芪正丁醇提取物与10 g柱层层析用硅胶研磨均匀后上硅胶(250 g)柱，用氯仿:甲醇:氨水:水体积比为70:26:2:2的混合溶剂，流速6 mL/min，每20～30 mL收集1份，共收集153份。TLC检查，合并相同或相近流份。将各成分段用碱性氯仿处理，挥干后在减压条件下升华，得到白色针状结晶，经鉴定为SW。

（2）从茎直黄芪中分离 。 赵宝玉等[5]从茎直黄芪中分离到SW。他报道的方法是：将茎直黄芪干草粉经酸水提取或醇类溶剂提取，上氢型阳离子交换树脂，先用去离子水洗至无色，然后用1 mol/L氨水洗脱，收集碱性部分，挥发至干，得到总生物碱粗品，总生物碱用氨性氯仿溶解，经硅胶柱层析，氯仿：甲醇：氨水：水（70：26：2：2）洗脱剂洗脱，分步收集洗脱液，经TLC检查，合并相同或相近部分，得到SW单体。

（3）从斑荚黄芪中分离 。 美国学者Molyneux[2]从斑荚黄芪中分离到SW。他报道的方法是：取其地上部分干燥粉碎，以热丙酮提取、冷却，得到的白色蜡状固体的初提物。初提物的水溶性部分经AG50W-X8阳离子交换树脂分离到碱性物质，经薄层层析显示此碱性物质含两种成分，这两种成分与生物碱特异性试剂反应皆呈阳性，再用氯仿将这两种成分加以分离，其中不溶性部分以白色针状结晶析出，经TLC、MS、NMR分析确定为SW。

2.2 从豆类丝核菌中分离

美国学者Schneider[8]和Broquist[9]分别从豆类丝核菌中分离到SW。Broquist报道的方法是：将菌丝体自然干燥，用乙醇抽提（Soxhlet, 24h），抽提物减压浓缩成糖浆状，加入H2O和CH2CL2移入分液漏斗内萃取，静置分层后弃去CH2CL2层，给水层加入CH2CL2并用碳酸钾调pH 10，萃取，静置分层后弃去CH2CL2层，水层中含有溶解在其中的SW，该水层经调pH 7，后上AG-50W-X8型树脂，吸附，用水冲洗，然后用I mol/L氨水洗脱，洗脱液浓缩，再上AG-50W-X8型树脂、吸附，再用I mol/L氨水洗脱，洗脱液冻干即得SW。

杨鸣琦[10]自行分离出10株豆类丝核菌，用改良Czaped’s培养25 ℃培养14 d，用镊子收集菌丝体，自然干燥后，用乙醇提取，提取物减压浓缩成糖浆状，加入3倍量的H2O：CH2CL2移入分液漏斗内，剧烈震摇，静置4 h，弃掉CH2CL2层，给水层加入CH2CL2并调pH 10，剧烈震摇，弃掉CH2CL2层（该层不能含有流涎胺）水层含有SW，该水层经浓缩并调pH 7，冻干就可得到粗品。水层浓缩后，经732型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，吸附30 min， 水冲洗，然后用I mol/L氨水洗脱，洗脱液浓缩，调pH 7，冻干即可得到浅黄色粉末，此即SW粗品，粗品纯化可得到SW纯品。

3.小结与展望

目前，从植物中分离SW的关键性问题是植物中SW含量极低，Molyneux从斑荚黄芪中测得SW的含量为0.007%～0.037%[2]，而曹光荣等研究表明黄花棘豆、甘肃棘豆及黄芪中SW的含量为0.005％～0.012%[3]，所以从植物中分离SW难以进行批量生产。而杨鸣琦等在国内首次分离到10株豆类丝核菌，并从中提取出SW，且测定到其自然干燥菌丝体中SW含量为1.23%～2.99%[12]，远远高于植物中的含量。因此，深入研究从豆类丝核菌中分离SW的方法，对于SW的批量化生产有着重大意义。

另外，SW的实验室分离技术还需要进一步的完善和简化步骤，以便于提高SW的生产效率和产量，这就为研究者提出了新的课题。

Progress  of  Swainsonine  Separation

WU Xu-jing1，YANG Ming-qi1*，BAI Chun-li2，ZHOU Hong-chao1

（1．College of Animal Science and Technology, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi  712100, China ； 2．Yulin agriculture school , Shaanxi  province, Yulin , Shaanxi  719000 ,China ）

Abstract：Swainsonine  is  the  mainly  toxicity  composition  of  locoweed. The resulte of research shows  it has obviously  anti-tumor  activion. In recent years, swainsonine was a new kind of anti-cancer medicine to get the tremendous concern. Currently, the laboratory of separating swainsonine technique have already made the very big progress, it was successful separating swainsonine from  swainsonine canesces ,Oxytropis,  Astragalus  plants  and  Rhizoctonia  leguminicola by Soxhlet extraction method 、column chromatography 、ion exchange chromatography、high performance liquid chromatography 、 extraction and so on. The article summarizes the separating technique of swainsonine.

Key words: swainsonine;separation 

参考文献：

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基金项目：国家自然科学基金资助项目（30270979）；陕西省自然科学基金资助项目（2003C119）。

作者简介：吴旭锦（1979－），女，陕西西安人，在读硕士，主要从事动物病理学研究。*通讯作者，E-mail:xbndymq@163.com