973项目申报书——2011CB200900-G微藻能源规模化制备的科学基础

二、预期目标

1. 总体目标

实现微藻能源规模化制备中的关键科学问题的重大突破，挖掘能源微藻优良藻种（株）选育原理，建立能源微藻藻种综合评价体系及适合于我国国情的可规模化培养的能源微藻藻种资源库；揭示能源微藻光能转化、光合固碳及油脂高效合成的机制；阐明光生物反应器设计、优化与放大原理，以及能源微藻光自养培养工艺优化及放大原理；阐明能源微藻细胞特性对能源微藻加工过程的影响规律以及加工工艺优化原理；构建微藻能源规模化制备的集成系统，并对其进行系统优化，明晰微藻能源规模化过程中的关键环节和具体的技术瓶颈，同时为技术瓶颈的突破提供创新的源泉，推进我国微藻能源的规模化进程。

2. 五年预期目标

（1）阐明优良种（株）的选育原理；建立可在户外进行规模化光自养培养的能源微藻藻种的综合评价体系；建立适合于我国不同地域、不同季节以及不同CO2气源与氮磷废水资源光自养培养且具有我国自主知识产权的能源微藻种（株）库和共享信息平台。

（2）以可规模化培养的典型能源微藻为对象，阐明光合作用、固碳、油脂合成与积累的主要机制及其原理，建立能源微藻全基因组代谢网络模型；实现能源微藻光合、固碳油脂合成与积累网络的改造，提高能源微藻光合、固碳和油脂积累效率；发掘3-5个关键因子，获得5-10个生长快、高产油脂的转基因株系。 

（3）建立不同类型光生物反应器的混合特性及光分布特性参数的CFD模拟方法；确定能源微藻在光生物反应器中培养的混合特性及光分布特性方面的敏感性参数；建立不同类型光生物反应器的评价方法，确定适合于能源微藻规模培养的光生物反应器类型；建立基于光照方向混合及光衰减特性的光生物反应器优化方法以及光生物反应器的放大准则。

（4）揭示环境因子诱导微藻中油脂过量积累与环境响应机制；建立基于重构全基因组代谢网络模型与多尺度分析方法相结合的能源微藻光自养培养过程优化与放大方法。

（5）建立不同能源微藻细胞特性的表征方法；确定能源微藻细胞特性对不同采收、破壁、油脂提取及生物柴油制备方法与效率的影响规律；针对不同能源微藻细胞特征及油脂组成，建立采收、破壁、油脂提取与生物柴油制备系统的集成与优化方法。

（6）构建微藻能源规模化制备系统的研究平台（生物柴油年生产能力达到10吨级），建立微藻能源规模化制备系统的集成与优化方法，为我国微藻能源的产业化提供科学理论和技术基础。

（7）发表论文200篇左右，其中SCI和EI收录论文100篇以上；申请发明专利25-35项，其中国际专利3-5项；出版专著1-2部。

（8）培养40-60名博士研究生，100名左右硕士研究生，形成一支在国际微藻能源这一快速发展领域得到同行认可并产生重要影响的研究团队。

三、研究方案

1. 学术思路

微藻能源生产过程所涉及的技术，具有学科交叉性强、技术面广、不成熟、单元复杂等特点，其外在表象是成本高。制约微藻能源形成规模化的根本原因是，微藻细胞生物学规律的基本科学问题和规模化过程所涉及的培养与能源产品加工及系统集成优化方面的工程科学问题，未得到深入系统的阐明。为此，本项目以推动微藻能源规模化制备中核心技术的重大突破为目标，以能源微藻户外大规模培养的实际条件为背景，以提高微藻能源规模化系统中各单元的效率为主线，研究从藻种选育到微藻能源规模化制备系统构建过程亟待解决的生物学及工程学方面的3个关键科学问题。

本项目的具体学术思路：从胞内代谢认知、规模培养、能源产品加工及系统集成优化三个层面进行深入研究，如图2所示。第一个层面主要以藻种选育及细胞本身基础代谢规律与机制发现为主要研究内容。首先从户外规模培养对藻种性能的要求出发，选育出可在不同条件下规模化培养的能源微藻藻种（株），阐明能源微藻的藻种选育原理并建立综合评价体系；然后以具有规模化培养前景的能源微藻（如小球藻等）为对象，开展其代谢网络及系统生物学研究，阐明微藻细胞代谢规律，以期为通过环境条件及分子生物学改造等手段进一步提高能源微藻的效率提供理论和实验依据。第二个层面主要从规模培养系统的过程工程角度研究微藻细胞对环境响应与机制和过程优化原理及放大方法。以组学技术研究藻细胞培养过程环境组学变化规律，揭示不同环境条件下的藻细胞表型规律和内在响应机制；进一步从生物反应器工程及细胞培养过程工程角度，开展光生物反应器设计及能源微藻光自养培养过程优化与放大研究，揭示规模化培养过程物质与能量转化的基本规律，以期为能源微藻的高密度高油脂产率规模化培养提供理论依据。第三个层面主要从藻细胞采收、油脂提取、生物柴油制备、非油脂组分综合利用等能源微藻加工及培养与加工系统集成优化角度，挖掘提高效率的原理和方法。

图2  本项目的学术思路

2．技术途径

本项目所涉及的技术途径如图3所示。以微藻能源规模化制备过程从微观到宏观的优化放大为主线，由实验分析手段结合模拟计算，完成微藻能源规模化制备过程中所涉及的生物学和工程学方面的关键科学问题的认识与研究。利用物理及化学方法对藻种进行诱变，利用高通量筛选技术获得优良藻种（株）；利用系统生物学技术及13C标记技术研究能源微藻胞内光合固碳、油脂合成与积累机制，利用分子生物学对代谢网络进行改造；利用CFD模拟、PIV测定技术结合热模实验研究光生物反应器设计与放大原理；利用恒化培养、环境组学及多尺度分析技术研究能源微藻光自养培养过程环境响应、优化及放大方法；利用细胞表面物理特性指导采收工艺的优化、利用细胞壁结构特性指导破壁工艺的优化、利用油脂组成指导甲酯化工艺的优化、利用非油脂组分的组成指导藻体残渣综合利用技术的优化；利用全生命周期分析技术对微藻能源规模化制备系统进行集成与优化。

图3 本项目涉及到的技术途径

3. 主要创新点与特色

3.1 主要创新点

（1）新思路：基于全基因组尺度认知与重构可规模化培养能源微藻的代谢网络，从源头上推进微藻能源规模化进程

优良藻种是微藻能源规模化制备的源头。对于通过诱变筛选等方法所确定的可规模化培养的能源微藻藻种，其效率的进一步提高，依赖于对其胞内代谢网络的认知与重构。能源微藻胞内代谢及油脂合成与积累机理的揭示，是深入认识其胞内物质与能量转换关系的科学基础，也是能源微藻代谢途径改造及培养工艺优化的关键所在。现有基于单一因子或单一分支学科的“剖分系统面向细节”的研究思路，难以全面认识能源微藻的代谢规律、提高能源微藻的效率。近年来发展起来的系统生物学研究证明，必须从系统水平考察出发细胞特性，才能设计出最佳的代谢工程策略。

本项目拟采用系统生物学思路重构可规模化培养、且全基因组序列明晰的能源微藻全基因组代谢网络模型，通过干试验（dry experiment，即模型计算与代谢网络重构）和湿实验（wet experiment，即具体实验验证）相结合，从以往的假设驱动（hypothesis-driven）研究模式转变为数据驱动（data-driven）模式，从而可高效系统地研究光合固碳、油脂合成与积累等能源微藻关键代谢途径及其变化规律，为甄别关键因子并通过基因改造显著提高能源微藻产油率奠定重要的理论基础，也可为微藻规模化培养过程中的物质与能量代谢提供理论指导。这种研究新思路不仅有望进一步提高可规模化培养的藻种性能，而且可为工艺优化提供重要的理论依据，从源头上推进微藻能源规模化进程。

（2）新策略：基于微藻能量和物质代谢特征的高效光生物反应器设计及培养工艺优化放大

微藻的低成本、大规模培养是实现微藻能源产业化的关键环节。能源微藻规模化光自养培养过程，面临着复杂多变的外部环境，光生物反应器内的光分布具有时空非线性变化特性，且微藻细胞之间也存在着一定的相互作用。因此，能源微藻代谢网络对外部环境及光生物反应器内的流场特性（特别是光照方向的混合特性）的应答机制极其复杂，使得目前的光生物反应器设计及微藻光自养培养工艺优化放大仍以经验为主，缺乏理论指导。

为此，本项目拟运用各类组学技术，揭示能源微藻规模化光自养培养系统中物质和能量转化及环境应答机制，以微藻胞内的能量和物质代谢效率为着眼点和评价标准，辅以CFD模拟、重构全基因组代谢网络与宏观代谢流多尺度分析等手段，建立基于微藻细胞关键生理特性、光照方向混合及光衰减特性相结合的光生物反应器设计与培养过程优化放大策略。这种基于微藻能量和物质代谢特征的高效光生物反应器设计及培养工艺优化与放大新策略，有别于基于经验的光生物反应器设计和工艺优化放大的传统方法，可为能源微藻低成本规模化培养系统及培养技术瓶颈的突破奠定重要基础。

（3）新方法：以湿藻为原料的高效低能耗微藻能源绿色制备方法

目前利用微藻制备生物能源的研究多以干藻为原料，但由于微藻细胞中水含量高（80%以上），干燥过程的能耗高、微藻胞内活性成分损失多、加工过程效率低，显著降低了微藻能源的经济效益。从文献报道看，目前还没有湿藻→油脂→生物柴油工艺过程的报道。因而系统地研究以湿藻为原料的高效低能耗微藻能源绿色制备方法，对于微藻能源规模化制备十分重要。

本项目拟采用湿藻为微藻能源加工的原料。首先对湿细胞进行破壁，然后利用油水二相比重的差异实现油脂及非油脂组分的分离，以分离出的微藻油脂为原料利用固定化酶促转化法实现生物柴油的绿色制备。针对非油脂组分含水量高这一特点，对于活性成分含量低的，分别采用厌氧发酵、水相热解、与煤混合形成水煤浆直接气化等方法实现其能源化利用；对于活性成分含量高的，则通过生物分离提取方法实现其高值化利用。该方法不仅可实现微藻能源的高效、低能耗绿色加工，而且可明显提高微藻能源规模化制备的经济性。

3.2 特色

（1）鲜明的生物学与工程学交叉特色：微藻能源规模化应用涉及的主要问题是典型的生物与化工相结合的生物产品工程问题，涉及多个学科，尤其是与工业生物技术相关的工程类学科，本项目通过生物化学、分子生物学、物理学、化学工程等基础学科领域的交叉，对微藻能源生产过程中所涉及的生命过程、工程科学以及系统科学进行理解与深化，解决微藻能源规模化过程中的关键基础科学问题，可加速微藻能源产业化进程。

（2）基础研究、应用基础研究与技术应用密切结合的特色：微藻是一类低等植物，通过对其生命过程的解析，从功能基因与蛋白、网络、、适应等不同的角度进行研究，将促进对微藻生命过程的理解、认识与应用；同时，在对微藻培养过程中的一些工程科学问题的深入研究，也将进一步促进过程工程科学的进步；以微藻加工后形成的包括液体燃料微藻生物柴油在内的系列产品为研究对象，对其中的一些过程工程科学问题的解决，将更直接地将科学知识转化为应用技术，项目本身的知识产出将直接贡献给生物柴油、生物燃气等能源产品的生产；此外，通过本项目所产生新的科学思想、技术平台和产品体系，将直接贡献给微藻能源产业化技术的系统开发研究。

４. 取得重大突破的可行性分析

（1）具备了开展微藻能源研究的先进技术平台。在能源微藻优良藻种选育与综合评价，能源微藻光合固碳和油脂积累的代谢机理，规模化光自养培养过程的环境响应与优化，光生物反应器设计与放大，细胞采收、油脂提取及生物柴油制备，非油脂组分资源化利用及微藻能源规模化系统集成等方面都具有了很好的研究条件和坚实的系统生物学研究基础。

（2）研究内容重点突出，研究对象明确，目标切实可行。紧紧围绕微藻生物能源规模化制备过程中所面临的困境，提出了3个关键科学问题及6个研究课题。所针对的研究对象是微藻能源规模化制备过程中的关键点，这些关键点的突破有助于为本项目的研究提供基础参数。反之，本课题研究出的新方法和优化原理也将用于指导微藻能源的规模化生产实践，同时发现新问题，提出新策略，使本项目的研究结果更具有实际意义，能够实现有限目标的重点突破，从而推进我国微藻能源的规模化进程。

（3）研究队伍强，工作基础好。组织了国内从事微藻能源研究的优势单位，主要研究人员在能源微藻藻种的选育、光合固碳及油脂代谢、光合生物全基因组模型构建、光生物反应器、微藻规模化光自养培养、细胞采收、油脂分离与转化、过程耦合和集成、系统优化等方面已经具有丰富的研究积累，学科交叉特色鲜明。拥有7个开展该领域相关的国家重点实验室、4个国家级研究中心和9个国家重点学科，先后获得6项国家技术发明及科技进步奖及国家自然科学奖2项，在国际上已经取得一定影响；这支研究队伍和我国微藻能源的产业界已经形成良好的产学研合作关系，通过基础研究获得的研究成果将直接应用于产业化技术开发。

课题设置

各课题间相互关系

以推动微藻能源的低成本、规模化制备中核心技术的重大突破为目标，以能源微藻户外大规模培养的实际条件为背景，以提高微藻能源规模化制备系统中各单元的效率及整体效率为主线，从解决微藻能源规模化制备过程中亟待解决的生物学及工程学方面的3个关键科学问题角度设置如下6个研究课题： 

课题1.  能源微藻优良藻种（株）选育原理与综合评价体系

课题2.  能源微藻光合固碳和油脂积累的代谢网络及系统生物学研究

课题3.  基于光照方向混合及光衰减特性的光生物反应器设计与放大原理

课题4.  能源微藻规模化光自养培养过程的环境响应、优化及放大原理

课题5.  能源微藻采收、油脂提取及生物柴油制备原理与方法

课题6.  非油脂组分资源化利用优化及微藻能源规模化系统集成

各课题相互之间的关系及课题与所需解决科学问题之间的关系如图4所示。各课题通过拟解决的3个科学问题实现有机关联，通过各自的研究目标形成了微藻能源规模化制备的理论基础与技术体系。课题1为课题2、课题3及课题4提供优良藻种及其表型；课题2为课题4的工艺优化提供生物学基础及可能的工程藻株、同时为课题3中有关光照方向的混合研究提供理论基础；课题3不仅为课题4提供培养用光生物反应器、同时为课题4中与光照相关的户外规模培养工艺条件优化及过程放大提供基础；课题4在规模培养基础上不仅为课题5提供了原料而且为课题2进一步实施基因改造提供实验反馈依据；通过课题5的实施获得本项目的主要能源产品生物柴油，其非油脂组分在课题6中进行资源化利用研究；课题6不仅对能源微藻加工系统进行放大而且对课题3、课题4及课题5进行集成，同时构建了微藻能源规模化制备系统。

图4 各课题相互关系及各课题对解决科学问题的贡献

四、年度计划

一、研究内容

1. 采用组合流式细胞仪分选和高通量筛选或组合混合富集培养、细胞分选和高通量筛选等组合方法，从自然环境和已有藻种资源分离筛选出具有速生长、高含油、适应不同气候、不同培养体系、不同CO2气源、耐低pH、高效利用氮磷废水等多样化特征的优良藻种。对所筛选藻株经理化诱变、环境胁迫、高通量筛选和批量评价，获得具有规模化培养性能的优良藻株。通过连续分离纯化获得遗传纯系，研究其繁殖方式及其环境影响机制，建立能源微藻遗传改良原理和方法体系。通过比较基因组学研究，解析可工业规模培养藻种优良株系优良性状的遗传基础。基于以上结果与信息，建立适用不同气候、不同培养体系和不同工艺、性状优良、生产性能稳定的能源微藻藻种和优良株系库，形成具有完备信息基础、能共享、具有自主知识产权的能源微藻藻种（株）库和信息平台。通过生物数据信息挖掘，建立基于规模化性能特征（速生长、高抗逆、高含油）的藻种综合评价体系。

2. 开展基因组、转录组、代谢组等组学研究，并结合13C标记法解析不同条件下小球藻等可工业规模培养的能源微藻的碳代谢途径，阐明代谢流迁移变化规律。结合公共基因组序列和代谢途径数据库，重构全基因组代谢网络模型，甄别能源微藻光合固碳和油脂合成与积累的因子。以光和CO2等为因子开展微藻细胞生理特性稳定的计量化学和动力学研究，结合转录物组学、代谢组学等技术，研究能源微藻高光效突变体光合途径的网络机制，为提高微藻细胞光吸收、传递和利用效率提供基础。基于重构的全基因组代谢网络模型，甄别和改造可工业规模培养的能源微藻的碳流分配规律和油脂合成积累的基因及高效光能利用和固碳的基因，构建高产油、高光效的转基因株系，以期为规模化培养提供优良藻株以及为规模化光自养培养工艺优化提供指导。

3. 采用CFD多尺度模拟技术和多尺度离散化超级并行计算机群系统，对不同类型光生物反应器（如敞开式跑道池及圆池、封闭式平板光生物反应器及管道式光生物反应器等）内部气-液-固三相体系的混合特性等进行模拟计算，获得不同混合条件下的流体混合特性参数。采用PIV和LDA等测试技术，进行混合特性模拟结果的实验验证与模拟方法的修正。结合光衰减模型，通过数学分析方法（如傅里叶分析和小波分析等）获得藻细胞在光生物反应器内的光暗循环频率、光区停留时间占循环时间比例和时间平均光强等光分布特性参数。对三角褐指藻、小球藻等在不同类型光生物反应器内进行培养，确定影响能源微藻高效率培养的敏感性参数，并对不同类型的光生物反应器的培养效率进行评价。基于获得的光照方向的混合特性及光分布特性方面的敏感参数，利用CFD对合适类型的光生物反应器的结构进行系统优化，结合CFD模拟计算结果与逐级放大试验，挖掘基于光照方向混合及光衰减特性的光生物反应器设计与放大原理，为规模化光生物反应器的设计提供依据。

4. 采用恒化培养和同位素13C标记等方法研究典型能源微藻（如小球藻等）不同环境条件（光强与细胞密度、CO2浓度与pH、温度、N等营养物）下的光自养培养过程以及生长模式转变（如异养转光自养）时基因组、转录组和脂组等的差异和变化规律；采用组学及13C标记等手段，结合所构建的微藻全基因组代谢网络模型，研究重要环境影响因子条件下的碳代谢和油脂累积的规律，阐析环境优化及胁迫条件下的代谢过程特征和细胞与环境相互作用机制；采用恒化培养或批培养方法开展不同环境条件下的细胞宏观代谢流研究，获得细胞生长与油脂累积过程动力学模型；研究既是碳源又是酸度平衡调节物的CO2的吸收规律及其与培养过程的耦合方法；采用恒化培养或批培养方法，对微藻光自养培养过程的在线参数（如pH、温度、CO2浓度等）、在线生理参数（如在线CO2固定速率、O2释放速率、细胞呼吸强度等）、离线参数（如细胞密度、油脂含量等）进行相关性分析，形成多尺度参数分析方法；在重构全基因组代谢网络模型的基础上结合宏观代谢流多尺度分析方法，建立适于微藻细胞培养过程优化的新方法；研究基于微藻细胞生理、光照方向混合及光衰减特性相结合的光自养培养过程放大方法，为规模化能源微藻光自养培养过程放大提供理论基础。

5. 针对能源微藻规模化培养过程中细胞特性的多样化，引入细胞大小、细胞形态、细胞膜组成、细胞膜电荷、细胞膜表面极性等参数，对能源微藻规模化培养过程中细胞特性进行表征，建立能源微藻细胞特性表征的方法；以此为依据，考察不同藻种、不同培养工艺等情况下微藻细胞特性的变化规律，为后续加工工艺的优化与建立提供理论依据；研究藻细胞密度、藻细胞形态及其易变性、大小、表面电荷等不同的物理特性，对各种方法的采收效率的影响规律及其机制，建立高效低成本、易放大采收工艺优化方法；研究细胞膜强度及水含量，对各种方法破壁效率的影响规律，建立高效低成本、易放大的破壁工艺优化方法；研究油脂组成对各种方法提取效率的影响规律，建立高效低成本、易放大的油脂提取工艺优化方法；设计并构建油脂到生物柴油的反应/分离耦合过程，研究油水共存条件下高效转化微藻油脂合成生物柴油的作用规律，包括三甘酯的转化，单甘酯、二甘酯和甲酯的变化规律及反应动力学，研究生物柴油转化过程中甘油的产生规律，达到甘油在线分离，实现生物柴油合成和甘油分离耦合的集成，为高效、低成本、易放大的微藻生物柴油制备工艺的建立奠定基础。

6. 解析能源微藻非油脂组分的多元特性，建立其表征方法，在此基础上系统考察不同的油脂提取方法对能源微藻非油脂组分组成的影响规律，根据能源微藻非油脂组分的多元组成特性，建立相应的微藻非油脂组分的高值化和能源化利用方法，实现能源微藻资源的综合利用。在此基础上，通过建立微藻能源生产过程各单元的优化放大工艺，然后构建微藻能源规模化系统，建立其系统集成与优化方法，以实现各个单元之间高效率的耦合，并系统考察耦合系统的经济性。通过分析微藻能源的生产、转换和运输、季节环境条件影响等过程中的能量平衡，从微藻能源生产过程中各单元能量的投入与产出、CO2排放、废水排放等角度综合考虑，对微藻能源生产过程进行全生命周期分析，评价其过程经济性，为推进微藻能源的规模化进程奠定基础。