探究课题生物组织中蛋白质的鉴定

一、课题分析

1．教学目标

（1）初步学会蛋白质的鉴定方法，领悟并能描述该实验的实验原理。

（2）探索该实验的最佳实验材料及稀释浓度，培养学生的科学素质和创新意识。

（3）如实观察并记录实验现象和结果，提高学生的实验操作能力和观察能力， 

（3）分析实验过程中出现的问题，培养学生分析问题和解决问题的能力。

2．背景描述

组成蛋白质的氨基酸分子是通过肽键互相连接起来的，其中的肽键结构与双缩脲（尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨）相似，双缩脲（H2NOC—NH—CONH2）在碱性环境中能与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。反应式如下：

但双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个－CS－NH2，－CH2－

                                                            NH2   NH2

NH2，－CRH－NH2或－CHOH－CHNH2等基因的物质以及乙二酰二氨 （O＝C－C＝O）等物质也有此反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

双缩脲试剂常常用于组织蛋白质的定性测定（如图）。

二．材料器具

1．实验材料：大豆、黄豆、鸡蛋、豆浆等， 

稀释2倍～10倍的蛋清等）。

2．仪器：双面刀片，研钵，石英砂，玻璃漏斗，试管，试管架，试管夹，纱布，镊子，吸管，小烧杯，试管刷。

3．试剂：双缩脲试剂，蒸馏水

三．教学建议

本课题的重点是初步学会蛋白质的鉴定方法，领悟该实验的实验原理。难点是规范地完成该实验的操作步骤，并能分析实验过程中出现的问题，从实验中找出该实验的最佳实验材料。根据实验内容，建议教师采用探究性实验和验证性实验相结合的教学方法。 

学生可以按4人为一组进行实验，通过颜色反应定性地验证生物组织中的蛋白质成分，让学生了解构成细胞的化合物中含有蛋白质，并学会蛋白质鉴定的操作方法，学会获得新知识、新的科学知识的途径和方法。

可以让同组内不同的学生分别选择不同的实验材料、不同浓度的实验材料，如选择提前浸泡的黄豆与没有浸泡的黄豆；豆浆；没有稀释的蛋清与稀释2倍～10倍的蛋清等。实验时要求学生能分工合作，体现合作精神。通过相互探讨，提高学生对实验材料进行选择和处理的能力，更深刻地理解教材中实验设计的科学之处，有利于培养学生科学的研究态度，提高学生的实验操作能力、观察能力和设计能力。通过让学生分析实验现象、撰写实验报告、提出改进实验的措施、改进实验的器具等方面让学生开展探究学习，使学生更好地理解知识，提高利用科学的研究方法来解决实际问题的能力，体现学生学习的主体性，利于激发学生的创新意识。

本实验所用的双缩脲试剂必须现配现用，否则实验不会成功。双缩脲试剂使用时，应先加试剂A(0.1g/mL的NaOH溶液)，造成碱性的反应环境，再加试剂B(0.01g/mL的CuSO4溶液)。

配制双缩脲试剂的方法：配制取10g氢氧化钠放入量筒中，加水至100mL，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液，瓶口塞上胶塞，贴上标签，写上试剂A。取1g硫酸铜放入量筒中，加水至100mL，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成质量浓度为0.01g/mL的硫酸铜溶液（蓝色）。瓶口塞上胶塞，贴上标签，写上试剂B。 

在鉴定前，可以留出一部分样液，以便与鉴定后的样液的颜色变化作对比，这样可以增强说服力。

四．探究活动

步骤之一   探索实现原理   创设探究实验情景

    设疑：生物组织细胞内的蛋白质是如何鉴定的？

步骤之二   探索实验材料    探索实验过程

包括对实验材料的探索，以及研究获得较好实验效果的蛋清浓度稀释倍数，颜色反应的规范操作等。  

设疑3：蛋白质鉴定的实验如何操作？要注意些什么？

步骤：①取1支试管，向试管内注入黄豆组织样液2mL（或者向1支试管内注入豆浆、或牛奶、或蛋白稀释液2mL）。②向试管中加入双缩脲试剂A（质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液），摇荡均匀。注意观察试管内溶液的颜色有什么变化。③再向试管中加入3～4滴双缩脲试剂B（质量浓度为0.01g/mL的硫酸铜溶液），摇荡均匀。

试管内溶液的颜色有什么变化                         

对照组1

试管内溶液的颜色有什么变化                          

对照组2

试管内溶液的颜色有什么变化                          

步骤之三      实验结果的讨论及小结

1．在实验中，最后的实验结果紫色反应不明显，试管内溶液的颜色还是呈现CuSO4的蓝色，这是为什么？

简析：这是因为双缩脲试剂B（质量浓度为0.01g/mL的蓝色CuSO4溶液）加得过多。

2．如何稀释蛋清才能取得较好的实验效果？

简析：在蛋白质的鉴定实验中，若用蛋白质作实验材料，必须稀释，以免实验后粘住试管，不易洗刷。方法：将鸡蛋一端轻轻敲破一小口，让蛋清流入容器中，然后按比例蛋清∶蒸馏水＝1∶9的比例混合搅匀，再用4层纱布过滤，放入滴瓶备用，这样配出的蛋清稀释液与双缩脲试剂发生反应后不会粘固在试管的内壁上，反应也彻底，试管也易刷洗干净。

3．对斐林试剂和双缩脲试剂的配方，叙述不正确的是                      (     )

A．都含有NaOH溶液和CuSO4溶液

    B．斐林试剂的配制是将4～5滴0.05g/mL的CuSO4溶液滴入2mL0.1g/mL的NaOH溶液中即成

    C．双缩脲试剂是将3～4滴0.01g/mL的CuSO4溶液滴入2mL0.1g/mL的NaOH溶液中混合而成的

    D．.双缩脲试剂含有两种试剂：质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液和质量浓度为0.01g/mL的CuSO4溶液

答案：C

4．在用双缩脲试剂鉴定蛋白质实验时，正确的操作是                          (     )A．2mL蛋白稀释液先加2mL0.1g/mL的NaOH溶液，再加3～4滴0.01g/mL的CuSO4溶液CuSO4

B．2mL蛋白稀释液先加3～4滴0.01g/mL的CuSO4溶液，再加2mL0.1g/mL的NaOH溶液

C．2mL蛋白稀释液，同时加入2mL0.1g/mL的NaOH和3～4滴0.01g/mL的CuSO4混合液

D．在2mL 0.1g/mL的NaOH和3～4滴0.01g/mL的CuSO4混合液中加入2mL蛋白稀释液

答案：A

六．深化拓展

1．用徒手切片法鉴定组织中的蛋白质

取新鲜的大豆种子（去种皮），用刀片切下极薄的一片放在载玻片上，先滴2滴质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液，片刻后，再加质量浓度为0.01g/mL的CuSO4溶液2滴，充分混合反应后，盖上盖玻片，在高倍显微镜下，可看到大豆细胞含有圆形的紫色颗粒。  

（摘自2003年《生物学通报》第4期    第36页）

2．蛋白质的颜色反应

（1）蛋白质的黄色反应

①蛋白质中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等。这类蛋白质可被浓硝化生成黄色的硝基苯衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变为橙黄色的硝醌酸钠。反应如下：

绝大多数蛋白质含有带苯环中氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应。

注：浓（d＝1.42g/mL）

②鉴定方法：

取一支试管加入稀释20倍的鸡蛋清溶液4滴，再加入2滴浓，用微火加热并观察现象，待试管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

蛋白质的颜色反应表：

3．蛋白质含量的测定与纯度鉴定

在蛋白质分离提纯的过程中，经常需要测定蛋白质的含量和检查某一蛋白质的提纯程度。这些工作包括：测定蛋白质的总量，测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量和测定最后制品的纯度。

测定蛋白质总量常用的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法和紫外吸收法等。

测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。如具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量；利用抗体－抗原反应，也可测定某一特定的蛋白质含量。这些生物学方法的测定与总蛋白质测定配合起来，可以用来研究蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的提纯程度。

蛋白质制品纯度的鉴定通常采用物理化学的方法，例如电泳分析、沉降分析、扩散分析等。（摘自  沈同  王镜岩主编  《生物化学》上册    第223页－第224页）

七．文献链接

1．施忆等编著  《探索·实验·研究》  浙江教育出版社  2002年版  第41页－第42页

2．人民教育出版社生物自然室编著    全日制普通高级中学教科书（试验修订本·必修）  生物第一册     2002年12月   第18页－第19页。

3．人民教育出版社生物自然室编著    全日制普通高级中学教科书（试验修订本·必修）  生物第一册  《教师教学用书》 2002年11月    第16页－第17页。

4．陈允飞  主编     《教与学整体设计》 高中生物（第一册）  2002年12月  

第22页－第23页。

5．郑光美主编       《生物学通报》  2000年      第10期    第28页

6．相关网址：http://biologic.cn2088.com/readnews.asp?NewsID=32

                                               萧山区第三高级中学    金小英