关于肉毒梭菌的研究进展

（甘肃农业大学动物医学院动物医学专业，甘肃兰州，730070）

前言

肉毒毒素是肉毒梭菌产生的一种神经毒素，能够通过抑制神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放而引起肌肉麻痹。肉毒毒素在培养液中以复合物形式存在，其中的毒性组分由3个非同源性结构域组成，是一种新型的金属蛋白酶。不同血清型的肉毒毒素能够特异性地作用于不同底物，这些底物在神经细胞的胞外分泌过程中发挥重要作用。肉毒毒素在胞吞胞吐机制的研究以及临床医学应用方面具有宝贵的价值。

正文

肉毒梭菌（Clostrdium botulium）是一种革兰氏阳性厌氧芽胞梭菌，其产生的肉毒毒素能引起人畜严重的中毒症状，甚至导致死亡。肉毒梭菌具有厌氧生长、低温生长产毒的特点，使其在日益普及的真空包装、冷冻食品及罐装食品中具有生长优势，从而成为这类食品中毒的主要原因之一。此外，肉毒毒素的神经毒作用，在当今肌肉痉挛、腺体分泌过度以及美容外科领域中正被广泛利用。因此，对肉毒梭菌的研究引起了广泛关注，研究的重点主要集中在肉毒毒素的相关领域，近年来，毒素的研究已经取得了长足的进步。

1 毒素基因簇及其

组成肉毒毒素复合物的蛋白编码基因通常成簇排列，不同的血清型、不同的株，其基因簇的组成和排列也不完全相同，A1型毒素基因簇的排列就有两种不同的方式。毒素基因簇位于A、B、E、F血清型的染色体上，位于C、D血清型的假溶原性噬菌体成分中，位于G型的大质粒上。

在迄今分析的所有肉毒毒素基因簇排列中，非毒素非血凝素基因(ntnh)全部位于紧邻毒素基因（bont）的上游区域，与毒素基因位于同一个操纵子中，并且此基因在小同血清型间的保守性很高，比相应的毒素基因的序列还要保守。编码血凝素组分的基因位于ntnh基因的上游区域，多个相邻血凝素基因构成一个操纵子。此外，大多数毒素基因簇都包含1个正基因botR(除E型外)，以及几个未知功能的开放阅读框。这些基因的排列在不同的血清型间存在差异。近来发现A2型肉毒梭菌毒素基因簇在orfx2的上游还存在有orfx3开放阅读框orfx1、orfx2、orfx3位于一个操纵子中，以多顺反子的形式转录:p47、ntnh、bont位于同一操纵子中，以多顺反子的形式转录。我们的研究发现,E型中也存在一个类似orfx3的开放阅读框。

肉毒毒素基因的表达，可能是由双组分系统的，这种方式可以是正也可以是负，但具体调节途径还小清楚。己经鉴定出1个具有正作用的转录蛋白BotR （ E型中没有发现）:其等电点为10.4,包含螺旋一转角一螺旋的结构基序;蛋白编码基因 botR是一个转录单位，位于毒素基因簇内。实验证明，A型蛋白BotR/A结合于ntnh和ha35基因的启动子区域，同时激活血凝素操纵子和毒素操纵子。 Bradshaw等使用穿梭载体将构建的轻链毒素在正常菌株62A和毒素基因簇缺失的菌株LNTO1中表达，研究发现BotR/A小仅是正因子，而且是Bont表达的必需因子：同时，在毒素基因簇内或者附近还存在参与负的基因或负因子结合元件。此外，毒素的合成也受到菌体代谢过程中的级联反应控制。

2 毒素的毒力

肉毒毒素能够引起人畜肉毒中毒，根据其抗原属性可分为7个血清型，分别命名为A～C型，其中A、B、E、F型引发人类肉毒中毒,C、D型引发动物、禽类肉毒中毒,G型引起中毒的报道较少。A型、C型又可再分为A1、A2型和C1、C2型毒素亚型。肉毒毒素是迄今己知的毒性最强的物质，其小鼠LD、介于0.1～1ng/kg体重，少至0.1～1µg的毒素就可导致成人中毒死亡。

人类肉毒中毒主要有3种类型:①食物性肉毒中毒，主要是由于进食了含有肉毒毒素的食品引起，也是人类肉毒中毒最兴遍的一种形式；②婴儿肉毒中毒，由于新生儿正常肠道菌群缺乏，其食入的肉毒梭菌芽抱可以萌发、繁殖、产生毒素，从而引起婴儿中毒;③创伤性肉毒中毒，类似于破伤风，由于伤口处污染的肉毒梭菌芽孢繁殖、产毒，毒素从伤口进入叔液循环而导致，比较少见。

3 毒素的作用机制

前体毒素中的非毒素组分可以在人畜的消化过程中保护神经毒素免受各种酶的消化以及胃酸的侵蚀。进入小肠后，小肠内的微碱性环境导致毒素复合物的解离， Bont穿过小肠表皮，进入血液和淋巴循环，进而作用于神经肌肉接头（NMJ）阻止神经递质乙酞胆碱（ACh）的释放，引起肌肉麻痹。有关Bont对神经肌肉接头的作用机制被研究得较详细，主要包括以下4个步骤。

①靶细胞的识别与结合

 Bont通过其HC结构域结合于胆碱能神经元的突触前膜。靶细胞的识别与结合需要神经节苷脂的存在，特别是GD1b、GT1b和GQ1b。然而，神经节苷脂分布及对毒素亲和结合能力的研究表明，神经节苷脂不是促进毒素结合的惟一分子，细胞表面的蛋白质也参与了这个过程。于是Montecucco等提出了毒素结合的“双受体(double-receptor)"模型:肉毒毒素及破伤风毒素与靶细胞的特异性牢固结合同时需要毒素与神经节苷脂、毒素与蛋白质受体间的相互作用。对A型、B型、E型毒素的研究发现靶细胞表面的突触结合蛋白质Ⅱ参与了毒素的识别结合过程，并且在神经节苷脂存在的条件下对毒素的亲和力明显增强，为“双受体”模型提供了有力证据。

②内化

    由于肉毒毒素是在神经元细胞的胞质中发挥作用，毒素分子就必须首先进入细胞质中，这个过程就是内化过程（internalization）。毒素结合于细胞表面后，不是直接从细胞膜进入，而是通过细胞的内吞，形成一个包裹毒素分子的酸性小泡。研究表明，毒素结合于神经细胞表面后，这种受体介导的内化过程是温度和能量依赖的，神经刺激能够加快这一过程。

③跨膜转运

    与破伤风毒素不同，肉毒毒素形成的这种酸性小泡并不逆行进入脊髓，而是滞留在运动神经元的突触前膜末端。小泡内的酸性环境使Bont分子构象发生变化，中性环境下埋藏在内部的疏水片段暴露于分子构象表面，使得毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双分子层内。毒素嵌入质膜后形成离子通道，这种离子通道是阳离子选择性的，相对分子质量小于700 000的分子可以通过这个通道。目前兴遍认为毒素轻链从小泡腔内转运到神经细胞胞质的过程与这种离子通道的形成密切相关，但具体过程没有形成一致看法，共有3种轻链转运假说模型：管道模型、裂缝模型和裂解模型。

对于离子通道的形成，现在认为主要是毒素的HN结构域的作用，尽管毒素轻链也参与了此过程。在BontA的HN结构域中存在与大肠杆菌素、白喉毒素等其他膜转运毒素相似的序列元件，这种序列元件被认为与离子通道的形成及轻链跨膜转运相关。虽然最初预测形成穿膜。α-螺旋结构的重链第659～681位肽段（GAVILLEFIPEIAIPVLGTFALV），在中性环境的晶体衍射结果中是以β-片层结构存在的，但是，随后合成相应肽段进行的研究证明，这种基序确实能够在离体环境中形成离子通道。根据实验中的构象能量结果计算，形成通道需要4个这样的螺旋相互作用。Bont在磷脂双分子层上形成通道的晶体结构，也说明离子通道的形成需要毒素HN结构域的四聚化。

④阻止神经递质的释放

在突触前膜，神经递质的释放是以胞吐的方式进行的。有一组SNARE蛋白，主要包括位于转运小泡膜上的VAMP、位于突触前膜上的SNAP-25和Syntaxin，以及一些胞质蛋白共同形成复合物介导了转运小泡与突触前膜的锚定、融合，是递质释放的必需蛋白。Bont通过特异性切割SNARE蛋白，阻止转运小泡中的递质释放，引起肌肉麻痹。各种血清型Bont的底物及肤键切割位点各不相同：A/E型主要作用于SNAP-25：B/D/F/G型主要作用于VAMP：C型毒素有2个底物，分别是Syntaxin和SNAP-25。近来也发现了某些对毒素切割不敏感的SNARE蛋白，如VAMP8等，可能是这些细胞抵御毒素作用的主要原因。

包含切割位点的短肤虽然能够与毒素结合，但不能被切割;某些血清型的毒素仅催化一个肽键，而另一个位于底物上的相同肽键却不能被切割;毒素对结合于膜上的底物催化活性较高，而对分离到的底物分子催化活性较低。以上这些实验结果说明，Bont识别底物的三维结构，而不仅仅是一级肤键结构。序列研究发现了1个有9个氨基酸残基的基序，这里称为SSR基序（the SNARE secondary recognition motif）。实验证明，尽管不在肽链切割位点附近，1个或多个SSR基序确实与Bont轻链发生相互作用。这个基序预测形成α-螺旋结构，3个负电荷残基位于表面。 VAMP和Syntaxin中有2个SSR基序，SNAP-25中存在4个这样的基序。与此基序发生作用的毒素部分还不清楚，可能是最为保守的N端100个残基区，这个区域包括一个预测为α-螺旋结构的片段（80-100），此片段在螺旋的同一面上富含正电荷。

BontA作用的结果是阻碍了转运小泡锚定后的递质释放引发过程，这个引发过程是钙离子依赖的，毒素的作用可以被胞内钙离子浓度升高所逆转;BontD/E/F作用的结果是阻碍了SNARE复合物各组分间的紧密相互作用，使其不能形成有功能的稳定结构;BontB/C/G作用的结果是使复合物与转运小泡或突触前膜的连接变得松散，不能介导质膜融合释放递质而是使这个复合物稳定性降低或者功能受损，在前述几个步骤影响了正常的递质释放过程。相反，一旦组成SNARE复合物，其中的相应SNARE蛋白就小再被Bont切割。事实上，单一血清型Bont切割SNARE蛋白，并不能阻止SNARE复合物的形成，这可能是由于形成复合物时，SNARE蛋白构象发生改变，松散的卷曲构象转变为小易被蛋白酶切割的。α-螺旋结构；也可能是SSR基序空间位置发生改变，不能被Bont识别所造成的。

BontA/B/E被酪氨酸蛋白激酶Src磷酸化后，毒素的催化活性及稳定性明显提高;而且磷酸化位点越多，切割活性增强越多。神经细胞内Src及PYK2等酪氨酸蛋白激酶的存在，似乎提示Bont的最终活化可能与信号转导途径紧密相连。

4毒素的治疗应用

肉毒毒素小剂量局部注释能够有效地抑制胞吐，又不引起强烈免疫反应等主要副作用，故其在多种人类疾病治疗中的应用得到快速发展。毒素注射可以反复多次，如果抗体产生，可以换用别的血清型毒素继续此治疗。现在主要应用的是BontA，己经投入商业化生产，别的血清型毒素正在实验中，比较有前景的候选毒素是C型毒素。如前述及，BontA的作用可以被钙离子浓度升高逆转，其余血清型毒素由于其作用不能被逆转，应该在治疗中更加有效，但事实发现，它们的有效持续时间都较短。

    肉毒毒素在疾病治疗中的应用主要包括3方面：①肌肉过度收缩等神经肌肉紊乱症状，例如肌纤维肌颤搐、磨牙症、肛裂、肛门痉挛、阴道痉挛、迟缓小能、食道痉挛等，以及整形、神经外科手术后的肌肉松弛阶段;②腺体分泌过多症状，例如多汗症、鼻炎、流涎症、鳄鱼泪l综合征等;③疼痛症状，例如紧张性痛、偏头痛、颈源性头痛、肌筋膜疼痛、慢性腰背痛、“网球肘”等。

    近年来，肉毒毒素应用增长最快的是美容外科领域。肉毒制剂对抬头纹、角尾纹的治疗非常有效最近也有报道用于嘴部、颈部的皮肤皱纹以及咬肌下颌角良性肥大，并取得了较好的效果。

5 肉毒毒素研究的展望

    虽然近年来对肉毒毒素的研究己经取得了很大进步，但仍然存在很多问题需要进一步研究。首先，需分离和鉴定Bont的相关受体蛋白以及结合结构域，阐明这种特异性结合的具体机制。其次，需阐明毒素轻链在运动神经元内的跨膜转运和激活机制，特别是pH值对Bont三维结构的影响。第三，晶体结构研究，例如对Bont内肤酶结构域的深入研究，能够促进毒素特异性抑制因子的发展。

    毒素在医疗上的应用也有待改进。首先是毒素体内作用时间的延长及抗体产生后候选毒素的开发。例如，可以构建不同血清型杂合毒素，检验其体内作用效果。其次是降低免疫反应。毒素注射引起的免疫反应主要是针对毒素重链C端，通过修饰改变这一区域能够有效缓解患者的免疫反应，改善毒素的治疗效果。第三，毒素重链在神经元靶向性跨膜转运中的作用，使其能够成为携带其他药物进入神经元的重要载体。

    此外，毒素特异的神经毒作用，在神经细胞作用机制的研究中，也是很有价值的实验工具。随着毒素结构和作用机制的进一步阐明，可以预见毒素疫苗、特异性抑制剂以及新的治疗用途将取得令人瞩目的巨大发展。

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