自行设计microRNA PCR引物来完成RealTime PCR检测

自行设计microRNA PCR 引物来完成RealTime PCR 检测

（虽然逊色于TaqMan 探针法，但成本低廉，足以满足大部分试验要求）

对microRNA 进行定量研究的经典方法是ABI 公司的探针法（目前国内HaiGene 也在售TaqMan miRNA 检测试剂盒），其采用特殊结构的茎环反转录引物对microRNA 进行反转录，之后采用MGB 探针进行RealTime PCR 定量分析，这种方法具有特异性高、定量准确的优点，但是试验需要订购ABI 公司的成套的引物试剂，成本很高。2008年Soroush 首次报道了miR-Q 技术【1】，该技术使用了含有tag 的特异性反转录引物，这样可以很好的区分相似度很高的mircoRNA （原理如图1A ）。2011年Peter 对miR-Q 技术进行了改良【2】，对microRNA 进行加A 后，采用含tag 和oligo dT 的引物进行反转录，之后采用含特异性序列的上下游引物进行RealTime PCR （原理如图1B ），这样保证了microRNA 的扩增特异性，其可以很好的区分单个差异的microRNA 【结果如图2所示】。实际的大规模应用当中也显示，该方法确实可以有效的对microRNA 进行定量研究，其结果的可靠性能比拟探针法【结果如图3所示】，已经被大量研究者所采用。本文将介绍从microRNA 提取、反转录、设计引物，到SYBR Green 法定量PCR 的全部过程，使初学者也能很快掌握要领。

图1A miR-Q 技术原理；图1B Peter 改良的miR-Q 技术原理

图2 使用Peter 改良的技术能够有效的区分相似度很高的microRNAs

图3 使用Peter改良的技术能够高效的扩增microRNAs

该SYBR Green法microRNA定量方案是建立在Peter改良的技术方法基础上建立起来的，包括三部分：高效率提取纯microRNA、通过加A法反转录获得microRNA cDNA、应用SYBR Green染料法对获得的cDNA产物进行RealTime PCR扩增。采用该实验方案进行microRNA表达研究操作简便、耗时短、重复性高、费用低、结果可靠【远高于市面上SYBR Green法的microRNA定量试剂盒（QIAGENE除外），略逊色于TaqMan法】，操作流程如图4所示。

下面将该方案的使用特点和方法进行详细阐述。

图4 SYBR Green法microRNA qRealTime PCR定量方案第一步 microRNA的提取

特别说明：（1）尽管该方案可以使用Total RNA最为反转录模板，但最佳的试验材料为纯microRNA，以下为纯microRNA 的提取步骤；（2）由于血清中microRNA的含量太低（个位数的copy量），所以该方案不能检测血清样品的microRNA。

1.提取试剂盒提取组织样本小RNA操作方法【HaiGene，Cat.No.:B1802】

(1) 向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。植物组织则再加入10μl β-巯基乙醇，混合均匀。

(2) 在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量研磨成粉状的组织加入到上述300μl miRNA Reagent A中，立即手腕用力震荡至组织粉末彻底溶解于裂解液中。室温静置5min以充解细胞。

(3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入350μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm离心5min，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。

(4) 向上述溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置5min。

(5) 13,000rpm离心10min，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。

(6) 向上述溶液中加入300μl异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。

(7) 分两次将上述溶液倒入到miRNA吸附柱中，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(9) 向吸附柱中加入500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(10) 吸附柱13,000rpm空离心2min，去掉残留的乙醇。

(11) 将吸附柱放入到新1.5ml EP管中，室温放置2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置2min，13,000rpm离心2min，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取1～2μl该产物，即可使用海基一步法miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：D1801）。

2.提取试剂盒提取细胞样本小RNA操作方法【HaiGene，Cat.No.:B1802】

(1) 贴壁细胞：胰酶消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用100μl 1×PBS重悬细胞后，加入300μl miRNA Reagent A颠倒混合均匀，室温放置5min。

(2) 悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用100μl 1×PBS重悬细胞后，加入300μl miRNA Reagent A颠倒混合均匀，室温放置5min。

(3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入250μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm离心5min，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。

注意：加入细胞体积数与miRNA Reagent B总体积数为350μl。如加入50μl细胞，则miRNA Reagent B使用300μl。

(4) 向上述550μl上清溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置5min。

(5) 13,000rpm离心10min，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。

(6) 向上述溶液中加入300μl异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。

(7) 分两次将上述溶液倒入到miRNA吸附柱中，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(9) 向吸附柱中加入500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(10) 吸附柱13,000rpm空离心2min，去掉残留的乙醇。

(11) 将吸附柱放入到新1.5ml EP管中，室温放置2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置2min，13,000rpm离心2min，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取1～2μl该产物，即可使用海基一步法miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：D1801）。

3.提取血液样本小RNA操作方法【HaiGene，Cat.No.:B1803】

(1) 向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。将150μl抗凝全血加入到上述300μl miRNA Reagent A中，立即手腕用力震荡混合均匀。室温静置5min以充解细胞。

(2) 向上述裂解完毕的裂解液中加入250μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm离心5min，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。

(3) 向上述溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置5min。

(5) 13,000rpm离心10min，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。

(6) 向上述溶液中加入300μl异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。

(7) 分两次将上述溶液倒入到miRNA吸附柱中，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(9) 向吸附柱中加入500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心1min，倒掉过滤液。

(10) 吸附柱13,000rpm空离心2min，去掉残留的乙醇。

(11) 将吸附柱放入到新1.5ml EP管中，室温放置2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置2min，13,000rpm离心2min，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取3～5μl该产物，即可使用海基一步法miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：D1801）。

第二步通过加A法microRNA反转录试剂盒获得cDNA

Peter改良的miR-Q技术需要加A后进行反转录，再进行定量检测，其原理如，如图5所示。

图5 microRNA反转录及定量原理图例microRNA反转录至第一链cDNA操作步骤【HaiGene，Cat.No.: D1801】：

按以下组分配制反转录反应液

*microRNA 0.01～0.5 μg（通常1~5 μl）

4×One step miRNA RT Solution 5 μl

10×miRNA RT Primer 2 μl

Rnase Free H2O Up to 20 μl

*注意：使用总RNA作为反转录模板时，可使用0. 1～2 μg。通常总RNA反转录效果要差于使用纯度较高的microRNA，不建议使用总RNA作为反转录模板。

在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:

37°C 60min

95°C 5min

反转录完毕后，可加入2～4倍体积的RnaseFree TE Buffer或ddH20将模板稀释后，用于RealTime PCR检测。

第三步设计双向特异性PCR引物进行荧光定量PCR检测

引物设计：利用Peter公布的miRNA引物设计软件miRprimer2软件，可批量设计检测miRNA引物，这可以极大的降低检测成本。详细原理在图5中已经介绍。 miRprimer2软件的中文使用说明可参考雷雨撰写的《miRprimer2软件中文安装及使用说明》，内有详细的操作步骤。

ABI PRISM 7500PCR仪的操作步骤，定量试剂盒为HaiGene Golden HS SYBR Green qPCR Mix【HaiGene，Cat.No.:

A2201】，内参为RNU6B。

终浓度

5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μl 1×

50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×

PCR Forward Primer(10μM) 0.2~0.4 μl

PCR Reverse Primer(10μM) 0.2~0.4 μl

cDNA模板1～2.5 μl

ddH2O Up to 20 μl

进行Real-Time PCR反应

通常采用两步法，程序如下：

Stage 1: 95℃15min

Stage 2: 95℃10s

℃0s 35cycles

603

参考文献：

[1] miR-Q: a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample. BMC Mol Biol. 2008. PMC2374797.

[2] Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011. PMC3135530.