干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建分析

*通讯作者。Author for correspondence.博士， 研究员， 主要从事植物分子生物学研究。E­mail:.收稿日期： 2006­03­31接受日期： 2006­05­25·研究简报·

干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建与分析

蔡勤安 1 ,王玉成 2 ,董玉芝 3 , 邢少辰 1 *,韦正乙 1

(1.吉林省农业科学院生物技术研究中心， 公主岭 136100； 2.东北林业大学林学院， 哈尔滨 150040； 3.农业大学林学院， 乌鲁木齐830052）

关键词：白花柽柳； 干旱胁迫； 抑制性消减文库 （SSH）； 表达序列标签 （EST）

中图分类号： S188 文献标识码： A 文章编号： 1006­1304(2007)02­0354­02

Construction and Analysis of Suppression

Subtractive Hybridization Library Under Drought Stress

CAI Qin­an 1 ,WANG Yu­cheng 2 ,DONG Yu­zhi 3 ,XING Shao­chen 1 *,WEI Zheng­yi 1

； drought stress； suppression subtractive hybridization(SSH)library； expressed sequence tag(EST)

白花柽柳( M.T.Liu.)是一种耐旱性 的植物。本实验利用抑制性消减杂交技术 （SSH） 克隆了白花 柽柳多个抗旱相关基因的 EST片段，并对这些 EST片段进 行了分析。

1材料和方法

1.1 材料

由吐鲁番沙生植物园提供白花柽柳 (

M.T.Liu.)插条， 用 25%PEG6000对苗木进行胁迫处 理， 分别在 1、 3、 6、 12、 24和 36h取材， 对照组培养在营养液 中， 液氮速冻后-70 ℃冰箱保存。

1.2 方法

按照 SDS方法提取 RNA。取少量电泳检测 RNA的质 量， 用紫外分光光度计定量。实验采用polyAT tract誖mRNA （Promega公司） 试剂盒分离系统分离 mRNA。

SSH操作依照 CLONTECH试剂盒 PCR­Select TM cD­ NA Subtraction Kit进行， 以 PEG处理为实验组， 以正常培养 为对照组。

回收上述 PCR产物连接到 pGEM誖­T Vector载体中， 连接产物转化到 TOP10菌株中， 在含有 X­gal、 IPTG和 Amp 的LB固体培养基上 37 ℃过夜培养， 然后根据蓝白斑检测文 库克隆的重组率。随机挑取白色克隆，提取质粒 DNA进行 PCR扩增， 电泳检测插入片段长度。

用 96孔深孔板培养重组菌落， 采用碱裂解法提取质粒。 利用 MegaBACE1000测序仪对 DNA样品进行测序，选取 100bp以上的序列与 GenBank比对， 并将所得序列对 NCBI 的Nr蛋白质数据库进行同源性检索。

2结果和讨论

2.1 总RNA质量检测

电泳检测总 RNA， 可见明显的 2条带， 条带亮度比值约 为 2颐 1， 表明所提取的 RNA未出现降解， 用紫外分光光度计 定量， 260 / 280为1.9（图1）。

图1.总RNA电泳图

Fig.1.Total RNA electrophoresis of

2.2 两轮PCR的结果分析

PCR结果 （图 2） 显示， 第一轮 PCR扩增后的电泳带很弱 (泳道 1～4)， 第二轮 PCR扩增后可看到电泳带明显(泳道 5～ 8)， 片段大部分集中在200～

2000bp之间。

第 2期 蔡勤安等：干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建与分析 2.3 SSH文库的质量分析

提取质粒后进行 PCR检测，蓝白斑检测显示文库的重

组率为 95%， 电泳结果表明片段大小在 0.5kb左右 （图 3）。

图2.两轮PCR扩增检测

Fig.2.The electrophoresis of the first and the second PCR products

1～4,t he first PCR products;5～8,the second PCR products;

M,DL2000marker.

图3.质粒PCR检测

Fig.3.The PCR identification of reconstructed plasmids 1～6,the PCR result of reconstructed plasmids of the length about500bp;

M,DL2000marker.

2.4 网上序列比对及EST序列同源性比较分析

根据每个EST可能的功能， 本实验将 100个EST分为 14个功能类别。

从图 4可以看出， 植物感受到逆境胁迫信号后立即激发 转录因子即反式作用因子， 反式作用因子与顺式作用元件结 合后， 激活 RNA聚合酶域转录复合物， 从而启动基因的转录 表达，最后通过基因产物对外界信号做出适合的调节反应， 转录因子在基因的表达中起关键作用 (Storey and Thomson，1994)。所得的结果也说明了这一点，转录因子所 占的比率也是最大的。

在渗透胁迫下， 柽柳产生了大量与信号传导、 转录、 热激蛋白、 离子转运、 植物的渗透调节、 信号传递、 转录、 活性氧清除、 蛋白代谢、 跨膜转运和离子平衡及光合作用等 功能有关的基因，它们与柽柳的抗渗透能力调节紧密相关 (Chander and Robertson,1994;Krishnamurth and Rhagwat, 19;Tsang ,1991)

。此结果对今后进一步研究这些基因

的功能提供了基本资料。

参 考 文 献

Chander P K and Robertson M.Gene expression regulated by abscisic acid and its relation to stress tolerance(J). , 1994,45:113～119

Krishnamurthy R and Bhagwat K A.Polyamines as modulators of salt tolerance in rice cultivars(J). ,19,91:500～504 Storey R and Thomson W W.Anx­raym icroanalysis study of the salt glands and intracellular calcium crystals of (J).

,1994,75:307～313

Tsang E W,Bowler C and Herouart D.Differential regulation of super­ oxide dismutases in plants exposed to environ mental stress(J).

,1991,3:783～792

图 4.预测功能分类中所占比例100个EST

Fig.4.100EST caky chart of forecasted function 1,渗调物质生物合成基因 （1.379%） ;2,光合作用(1.724%);3,活性氧清除剂 (1.034%);4,跨膜转运和离子平衡(1.724%);5,胁迫蛋白(2.758%);6,膜流动性 (0.344%);7,信号转导(3.44%);8,新陈代谢(2.758%);9,转录因子(9.655%);10,蛋 白合成(4.482%);11,细胞壁合成(1.034%);12,细胞骨架(0.6%);13,细胞

(0.344%);14,蛋白代谢(3.103%)。

1,osmolyte biosynthesis gene(1.379%);2,photosynthesis(1.724%);3,reactive oxygen scavengers(1.034%);4,transmembrane transport and ion homeostasis (1.724%);5,stress protein(2.758%);6,membrane fluidity(0.344%);7,signaling

conduction(3.44%);8,metabolism(2.758%);9,transcriptional regulators

(9.655%);10,protein synthesis(4.482%);11,cell wall synthesis(1.034%);12,

cytoskeleton(0.6%);13,cell division(0.344%);14,protein

metabolism

(3.103%).

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