农产品加工贮藏专题论文

摘要：酶联免疫分析法作为快速检测技术中的重要一种，在水果和蔬菜农药残留的快速检测中发挥着重要的作用。本文简单介绍了概述了酶联免疫分析法的技术要点，对其在检测中存在的问题进行了分析，并对其应用前景进行了展望。

关键词：酶联免疫分析法 抗体 抗原 半抗原 抗体抗原结合物 农药残留

The Technology of ELISA （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）and its perspective 

in The Detection of Pesticide Residue in Fruits and Vegetables 

Abstract  As a important kind of rapid detection，ELISA plays an crucial role in the pesticide residue of fruits and vegetables. This article simply introduces the essential of ELISA and analyses its problems in the analysis in detections, it also makes a perspective for the application of ELISA.

Key Words：ELISA; Antibody; Antigen; Haptens; Conjugate; Pesticide Residue

我国作为世界上最大的蔬菜水果生产国和消费国，仅09年蔬菜的生产就达到了5.9亿吨。果蔬的生产中农药（杀菌剂，杀虫剂，除草剂和植物生长调节剂）的使用不可避免，因此农药残留对人们的健康和环境的污染构成了严重的威胁，也是果蔬消费和贸易中存在的突出问题，越来越引起人们的重视，特别是在进出口贸易中，成为检测的重要指标。农药残留对人体的毒害作用除表现在影响生理活性酶的功能外，还对系统机能构成潜在的危害，甚至会降低机体的免疫功能，表现有致癌、致畸、致突变的作用[1]。对于食品中农药残留的检测，除传统的GC、HPLC、GC—MS、HPLC—MS等方法[2-3]外，免疫学技术的应用也越来越深入，其中应用最广的是以固相载体吸附抗原/抗体为基础的酶联免疫分析法。除了具有传统的仪器检测的灵敏度高，检测精准外等优点外，还有快速，不需要复杂的前处理，检测成本低便于推广等优点，并且能同时进行大批量样品检测。对于水果，蔬菜等特点农产品酶联免疫分析法检测有着重要的应用[3-5]推广意义。在美国，有关官方机构，如环境保护署(EPA)、农业部食品安全检验司(FSIS—USDA)和化学会(AOAC)已制定了农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则[6-7] ，明确了测定结果的法律效力。特别的，美国化学会AOAC已将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为农药残留的三大支柱技术。

1.酶联免疫分析法的原理

酶联免疫分析法（enzamy linked-immunabsorbed assay）简称ELISA，基本原理是将特异的抗原抗体免疫学反应和酶学催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应。ELISA是通过在合适的载体上，酶标限定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与未知抗原竞争限定量的标记抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定的底物参与下，复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降解底物与显色是成正比的，通过分光光度计测定，从而确定是否存在未知抗原或含量[3]。

2. ELISA在农药残留检测中应用的技术要点

ELISA 的核心技术是抗原抗体的特异性反应和酶对底物的催化作用。抗原有两个特性，即免疫原性和反应原性。既具有免疫原性又具有反应原性的抗原称为完全抗原，而只具有反应原性没有免疫原性的抗原称半抗原。免疫原性是指抗原能刺激机体产生抗体，反应原性是指抗体和抗原能进行特异性结合反应。酶与抗体或抗原结合后还要能保持对底物的催化作用。

2.1半抗原的设计合成

农药分子大部分都是小分子物质（分子量小于1000）, 本身不具备刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性，不能刺激机体产生抗体，必须与大分子载体耦联后才能刺激机体产生抗体，而蛋白质就是大分子物质的最佳选择。

Friei[8]等 认为一个理想的半抗原应包括待测物的特征结构、便于机体对特征结构进行识别的连接臂及其末端可与蛋白载体进行共价连接的功能基团。因此，将农药分子直接和蛋白质偶联或得到最大程度模拟待测农药分子结构特性的合成物质与蛋白质偶联便可以刺激机体产生抗体。他们认为，由于和载体连接后应尽量保证该农药分子获合成分子的特征结构最大程度的被机体识别，才能制备出有预期选择性和亲和性的抗体，因此农药分子或合成分子与载体之间必须有4-6个C原子的连接臂，使半抗原突出于载体表面，这样才能容易被机体识别，并产生免疫反应。而且间隔臂上也不能有特征抗原决定簇。

对于同一类农药分子，具有相同的特征基团，因此，可以设计合成具有这类基团的分子来模拟农药分子，与蛋白分子偶联后对机体进行免疫产生能针对这类农药分子的抗体，来对这类农药残留进行测定。

蛋白质连接的半抗原的数目对诱发抗体有一定的影响，一般认为20~40 个之间为宜。早期认为，高结合比有利于产生高效价的抗体，但高结合比抗原易导致动物免疫麻痹，一般认为以5~15 个左右为宜，但不应过低，否则效价特异性差[ 9 ]。

1. 2. 1 直接方法合成人工抗原。

农药分子半抗原如果有反应功能团,则可根据具体情况用适当的双功能交联试剂与交联方法使半抗原与载体偶联。对于—COOH半抗原,可利用—COOH通过混合酸酐法、活泼酯法或碳二亚胺法（DCC)等方法;对于氨基半抗原,则多采用重氮化法或戊二醛法;对于—OH半抗原则可直接与丁二酸酐衍生后再与蛋白质交联;对于—SH半抗原则可通过同源或异源双功能试剂交联;而酮基半抗原则常用氨基氧乙酸化。

1.2.2 衍生方法合成人工抗原

如果农药分子中不含有反应功能团,则需先通过衍生过程在农药分子内产生活性功能团再用双功能交联试剂使之与蛋白质交联。不同的农药应选择与之相适用的衍生方法,目前比较常用的有以下方法,用与半抗原结构相似的但有反应活性基团的商品化学试剂。

另外，还可以利用半抗原分子的代谢产物来合成抗原，和半抗原分子具有同样的免疫原性，也能得到相应的免疫抗体。农药衍生不能导致半抗原分子结构发生明显改变，否则抗原性将发生变化。如果半抗原有反应功能团，则可根据具体情况用适当的双功能交联试剂与

交联方法使半抗原与载体耦联。Aaaa[7-10]

2.2 载体的选择

由于蛋白质结构复杂、免疫原性好，不仅可以增加半抗原的分子量，而且可以利用其强免疫原性诱导免疫应答，对半抗原产生载体效应，故一般均选择各种蛋白质作为载体。常见的有牛血清白蛋白(BSA)、鸡蛋清蛋白(OVA)。

对于ELISA中的包被抗原来讲，还要和包被板结合，所以对于蛋白来讲，能和包被板紧密结合，所以选择蛋白分子作为载体既能提高免疫原性aaaa[11-12]，又提高了实验的可行性。

一般来讲BSA不易变性，价格便宜，而且氨基含量高，物理化学性质稳定，在不同离子强度，PH值下，有机溶剂存在下，都能和半抗原连接，并且在偶联后还能保持可溶性的状态，因此使用较为广泛aaaaaa[7]

2.3 酶标农药抗原的合成

在进行动物免疫前，要测定结合物中半抗原数目。只有结合物中半抗原的数目合适才能发挥最大的免疫原性，数目太多或太少都会使诱发抗体的能力都很差。用于合成农药载体蛋白结合物的方法，在不引起酶失活的情况下通常都可以用来连接酶与农药，制备酶标农药抗原aaaaaaa[13]

2.4 抗体的制备

与蛋白载体相结合的农药半抗原或者合成半抗原可以直接用来进行免疫动物，例如小白鼠，大白兔等，每间隔一段时间加强免疫一次，一般六个月左右可获得满意效价的抗血清，结合物免疫原性差的情况下，则需要很长时间的免疫才能获得免疫效价的抗血清aaaaa[14].抗体的产生一般可采用两种途径，多克隆抗体技术和单克隆抗体技术aa[15]。

2.4.1 多克隆抗体（polyclonal antibody）

多克隆抗体的制备比较简单，采用天然抗原（对于农药分子来说直接可以作为抗原，不必进行半抗原的设计与合成）免疫动物制备的血清，为多种抗体的混合物。多克隆抗体具有生产成本低、方法简便、来源广泛、易于制备等特点，但是其抗体的特异性不够强，会随着动物种类及个体差异而有变化，易发生交叉反应，而且生产数量也受，因此不利于生产大批量商品试剂盒。

在初次免疫的过程中需要加入等量弗氏完全佐剂，增加抗原免疫原性，是动物能够更容易产生抗体。

2.4.2 杂交瘤技术生产单克隆抗体 （monoclonal antibody）

由单一纯系细胞合成的抗体称为单克隆抗体，其重链、轻链、独特型完全相同，性质纯、效价高、特异性强，可以避免血清学上的交叉反应。在半抗原载体结合物对动物免疫后，获得效价较高的抗血清后，将动物的脾脏细胞分离，并和瘤细胞结合，然后筛选出能分泌特异性抗体的细胞，并测定这些抗体的的效价，选取理想的细胞培养，这些细胞既具备了脾脏细胞能分泌抗体的功能，又具备了癌细胞无限增值的功能。

相对于多克隆抗备技术来说，单克隆抗备过程复杂，对设备和技术的要求相对较高，成本费用也较高，但是单克隆抗体具备性质纯、效价高、特异性强，可以避免血清学上的交叉反应等优点，并且可以大批量生产，在生产商品试剂盒上有很大应用价值。

2.4.3 重组抗体 (recombination antibody)

与单克隆抗体和多克隆抗体不同，重组抗体的制备不需要细胞[16]，可以将指导抗体合成的功能基因转移到其他有机体中，比如器官，细胞等，最终能进行抗体的表达，筛选和收集。

由Moghaddam等[16]（见约稿文献24）制备的scFv链对抗黄曲霉毒素B1的抗体，对其有6×10-9 的亲和力，然而，现在对与黄曲霉毒素来说，有关重组抗体的报道还比较少。

制备重组抗体最大的困难就是怎么保持或者改进抗体与待测物结合的能力。另外，模拟抗体（比较大的一个概念），比如说重组抗体，可以不依靠动物来产生，许多种类的模拟抗原（例如分子标记聚合物[17-18]）等虽然已经用来作分析用了，但是还没有相关的文献报道。

3. ELISA在水果蔬菜农药残留检测中的应用

ELISA试剂盒可用于果蔬农药残留检测，正如本文开始所讲，ELISA具有很多优点，所需设备简单或者不需检测设备，样品前处理程序简化：液体样品，果汁、菜汁等通常不需前处理，可直接取样检测；固体食品，如糖果蜜饯等经抽提剂抽提、浓缩并重新溶于水溶液中即可取样检测，可在几十分钟至几个小时内完成多批次样品检验(如用96孔微量 ELISA酶标板法可同时完成44批次样品的检测)，检验成本低 aaaaa[19]，对操作技术要求低，非常适合于现场应用，特别是对于果蔬之类对新鲜程度要求比较高的农产品和食品。

ELISA不仅可用来定性筛选，而且也可以用来定量分析，对很多农药的检测水平可达纳克(ng)甚至皮克(pg)水平。自20世纪80年代开始尝试把ELISA应用于食品农药残留检测以来，到目前国内外已有大量文献报道。检测的食品范围不仅仅包括水果、蔬菜等还有饮料、啤酒、葡萄酒、鱼、肉、猪油、奶、植物油、蜂蜜、豆类、谷物及谷物加工产品等。国外有关食品中杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物(昆虫)生长调节剂等农药残留。aaa[20-22]。

    尽管优点明显，但在应用中ELISA同样存在缺点和问题。ELISA检测系统中的抗农药抗体对于结构非相关的靶抗原(农药)表现极高的特异性，但某些与检测农药结构密切相关的农药，或待检农药的代谢产物可能与抗待检农药抗体发生不同程度的交叉反应。如果样品中存在这些物质，将导致定量检测准确度降低，使该农药的定量检测降为半定量或定性检测或者出现定性假阳性与假阴性，从而大大影响ELISA在食品农药残留检测中的可靠性和灵敏度。但从另一个角度看，这种交叉反应又是特别有用的，利用这种交叉反应，可用抗一种农药的抗体对包括母农药在内的结构密切相关的类似物及代谢产物进行多种农药残留的总量检测。

由于食品的样本类型复杂，基质效应可能抑制免疫结合反应，不同品种农药性质各异，样本处理方法存在许多不确定性，同时抗体特异性和稳定性对检测结果影响机制尚不明确，影响其特异性和稳定性的因素还不是很清楚，从而使得ELISA在食品农药残留检测中的不确定因素增多且不易控制，难以实现标准化。这在一定程度上了ELISA在食品农药残留检测上的应用。

5.ELISA用于检测的前景展望

    上文提到在ELISA监测系统中，特异性抗原可能会对具有抗原相关结构的非靶标分子产生特异性反应，正是由于具有这一特点，我们可以把抗几种结构相关或非相关的农药抗体混合，利用这种混合抗体进行几种农药多残留分析，对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品，可以节省大量的时间和工作量。

    要解决好上述问题，在以后要努力做到：(1)在设计合成农药半抗原的过程中要注重多学科知识的联合，并引人组合化学、计算机模拟、立体化学设计理念和生物活性高通量筛选技术，建立不同农药结构与活性关系的评价模型，进一步提高农药半抗原筛选效率和命中率；(2)应对ELISA对食品农药残留的结果和理化分析结果进行相关性试验评价，同时将ELISA对食品农药残留快速定性筛选技术与色谱、质谱准确定量检测结合使用更为方便。

总之，目前ELISA应用于食品农药残留免疫检测尚存在一定局限性，也不可能替代传统的色谱分析技术。但ELISA分析技术自身优势和在方法上的不断完善，尤其是随着亲和力强、特异性高的标准化抗体生产技术的突破和免疫传感器技术的日臻完善，ELISA检测技术会成为食品农药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。

参考文献

[1]蔡道基．农药环境毒理学研究[M]．北京：中国环境科学出版社．1999．

[2]Yuk Y W．Analysis for atrazine in foaifield cornmeal and corns using a commercialy available enzyme immunoassay microtiter plate[J]．Bull Evitam Toxicol，1993，51：171—173．

[3]Kaufman B M，Clower M．Immunoassay of pesticides[J]．J Asso~Of Anal Chem，1991，74(2)：239—247

[4]Gazzaz S S，Raseo B A，Dong F M．Application of immunochemical assays to food allalysis[J]．Crit Rev Food Sci Nutr，1992，32：197—229．

[5]JohnH，Skerritt．Enzyme—linked immunosorbent assay for quantation of organophosphate pesticides：fenitrothion，chlorpyrifos—myth—yl and pirimiphos—-metyl in wheat crain an d flour—-miling fractions [J]．J of AOAC International，1992，75(3)：219—228．

[6]Krotxky A J，Zeeh B．Immunoassays for residue analysis of agrochemicals proposed guidelines for precision， standardization and quality control[J]．Pure and Appl Chem，1995，67：20—2088．

[7]陈新建．免疫学在植物学科中的应用[M]．北京：中国农业大学出版社，1998．

[8]Frieia J．Detection of pesticides residuces by enzyme immunoassay [J]．Pestle Sci，19，26：303—317．

[9]李俊锁,钱传范.农药残留的免疫分析及其进展[J].农药科学与管理,1999,(增刊):37-43.

[10]吕康博．农药及其代谢物的酶免疫分析技术[J]．农药科学与管理，2000，21(5)：15—18．

[11]Tamps P T．Recent advances in multiple antigen peptides[J]．J Immunol Meth．1996，196 14—32．

[12]周思祥，刘福成．农药人工抗原的合成进展[J]．农药，2005，44 (8)：337—341．

[13]Mafiapilar M．Development of all enzyme—linked immunoserbent assay for carbaryl[J]．J A c Food Chem，1993，41：423—430．

[14]Newsome W H，Shields J B A．Radioimmunoassay for benomyl and methyl 2一benzimidazolecarbamate on food crops[J]．J ASdc Food Chem，1981，29：220—222．

[15]刘廷凤，杨敏娜，刘亚子，等．菊酯类农药酶联免疫吸附测定研究进展[J]．环境科学与技术，2006，29(4)：100—102

[16]A.Moghaddam,I.Lobersli,K.Gebhardt,M.Braunagel,O.J.Marvik,J.Immunol Methods 254 (2001) 169 

[17]J.Jodlbauer,N.M. Maier,W.Linder,J.Chromatogr.,A 945 (2002) 45.

[18]F. Navarro-Villoslada,J.L.Urraca,M.C. Moreno-Bondi,G. Orellana,Sens.Actuators,B 121(2007) 67

[19]Stercen J L，R0bert J A．Detection of aldicarb sulfone and carbofu—raninfortifieldmentand hverwith commercial ELISA kits after rap—id extraction[J]．J Asric Food Chem，1993，41：2006—2010

[20]王振国，宋广文，王君双．食品农药残留免疫学技术检测[J]．吉林农业大学学报，1997，19(3)：113—120．

[21]高宏斌，许艇，李季．免疫分析方法在拟除虫菊酯类农药残留检测中的应用进展[J]．农业环境科学学报，2006，25(增刊)：425—428．

[22]郭玉莲．农药残留的酶联免疫分析技术及研究进展[J]．农机化研究，2006(2)：201—203．