中药效应物质基础和质量控制研究的思路与方法

中药效应物质基础和质量控制研究的思路与方法

李　萍3,齐炼文,闻晓东,盛亮洪

中国药科大学现代中药教育部重点实验室、生药学教研室,南京210038

【收稿日期】　2006211220

【基金项目】　国家自然科学基金项目(No.30530870;No.

30472160),国家杰出青年科学基金(No.30325046)

【3通讯作者】　李萍:教授,博导,教育江学者特聘教授,Tel:

025*********,Fax:025*********,E 2Mail:liping2004@126.com

的化学成分,它是阐明中药作用奥秘的关键,是中药质量控制的基础与核心,是中药材及其产品安全、有效和质量稳定、可控的保障。由于中药作用的整体性、中药成分和作用机制的复杂性,使得中药效应物质基础的阐明一直进展缓慢,成为制约中药现代化、产业化和国际化进程的瓶颈。因此寻找适于中药复杂体系效应物质基础的研究方法,阐明中药效应物质基础及作用的本质,进而建立科学的质量控制方法,一直是中药研究的关键科学问题。

1　传统中药药效物质基础的研究模式

长期以来,国内中药效应物质基础研究的主流模式主要是借鉴国外对天然产物活性成分研究的两种基本策略:一是在化学成分提取、分离和结

构鉴定基础上利用药理模型(整体动物、离体器官、细胞和分子等模型)对得到的纯化合物进行生

药进行活性追踪的提取、分离和结构鉴定。多年来这样的研究方法阐明了一些中药的效应物质基础,对中药的质量控制起到了一定的作用。如本实验室对贝母、冬虫夏草、四季青等中药的化学成分进行了深入研究,阐明了其有效部位和化学成分,建立了这些药材的有效成分群化学指纹图谱和多个指标成分同时定量相结合的质量控制方法[1214]。

但是,国内外学者在研究中也不断发现临床上治疗某些疾病很有疗效的中药,却在某个动物试验或体外模型上验证不出特定的活性成分。另一方面,许多中药或植物药粗提物有效,但随着逐步分离纯化,有效部位的活性越来越弱,最后甚至得不到有活性的单体成分。同时,科学家们越来越多地发现中药或植物药中存在着成分间相互协同作用[15217]。以银杏叶为例[16],银杏叶提取物

(EGb761)中的黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素类、少量有机酸和儿茶素等酚酸类成分起着互补和协同的作用,EGb761的药理作用是各种相对固定组成的各组份共同作用的结果,某一种活性成分均不能代表其整体的疗效。因此,中药的多成分、多靶点和整合效应逐步成为国内外学者的基本共识[18,19]。可见,传统的中药有效成分的研究模式不能全面反映中药多成分、多靶点和整合作用的

特点。

2　现有中药质量控制模式的分析

基于上述药效物质基础的研究模式,目前国内外中药质量控制的主流方法:一是在化学成分和活性研究的基础上,建立中药中的某一或几个有效成分(主成分)的定性、定量分析方法,进而控制中药的质量,目前已成为我们国家药品标准中中药质量控制的主要方法之一。二是考虑到中药

体表现,是多成分、多靶点协同作用的结果。因此中药的疗效既不是单一活性成分的作用,也不是多种成分活性的简单相加,尤其是中药复方更是如此,单一的活性成分或指标成分难以反映中药所体现的整体疗效。指纹图谱的方法虽然考虑了尽可能多的成分,但“成分与药效之间的关联性”在现阶段还没有得到有效的表达。

因此,现有的中药质量控制模式虽然为保障中药及其产品的有效、安全和质量的稳定可控发挥了重要的作用,但还不足以说明中药的整体作用和作用的多成分、多靶点协同特点。

另一方面,中药质量控制应该考虑中药体内过程的影响。传统的中药研究模式注重药物对人体的作用,重点研究中药中到底含有什么成分,什么成分能在药理实验中显示活性,往往使研究走入误区,难以真正地阐明中药的效应物质基础和药效作用机理,难以建立科学的中药质量控制模式。任何药物都是通过与人体的相互作用来发挥疗效的,中药所含成分及其复杂,要想将其成分逐一地阐述清楚,再进行药效、药理学研究,几乎是不可能的,况且成分分离后,彼此之间的相互作用消失。为此,应该重视人体对药物的作用。传统中药大部分以口服形式入药,就口服中药而言,其在体内发挥作用需要通过以下几个环节:口服给

药后,经消化道、肠道菌群作用,生成一种由中药固有成分及其代谢产物组成的混合物,有的直接被排泄,有的被选择性吸收;经胃肠道吸收的药物经血流进入肝脏,在肝代谢酶的作用下,部分或全部成分发生生物转化,生成新的物质;通过肝脏后,进入全身的血液循环,与血液中的血浆蛋白发生可逆性结合;最后随血液循环到达全身各个部位的靶器官、组织,与靶细胞膜或细胞内特异性的酶或受体结合,进而影响细胞内第二信使分子产医治疗疾病是以整体观为基础,拟定调整人体自

身功能的治疗方案(中药口服);中药是一个复杂体系,一种中药往往含有结构、性质不尽相同的多种成分,从大分子到小分子,从水溶性成分到脂溶性成分,从无机物到有机物,不同性质的成分数量多、结构差异大、含量差异显著,复方的情况更加复杂,这些成分又对人体的复杂系统产生整合、协调的作用。但是,对一味中药或一个复方及其治疗的病症而言,并不是所有的成分都是必不可少的,需要首先将它们看成一个有机的整体,建立一种新的化学物质分离模式,这种模式能够实现对整体中的化学物质依据活性差别进行分离,而不是传统模式的依据其物理、化学性质差别进行分离,也就是建立药效物质基础的生物分离新模式。应用这种新方法,阐明中药复杂体系中的有效物质组合,排除无效物质组合,对有效物质组合应用现代分析技术,开展进一步的在线化学结构鉴定工作,阐明药效物质基础,建立科学的质量控制方法。近年来,本实验室遵循中药的整体性、协同性和多靶点作用特点,从中药活性成分的生成、吸收、分布、靶向作用和代谢的全过程对中药开展系统的研究。采用透析、微透析取样和现代分析手段(HPLC 2DAD 2ELSD 、LC/MS 、HPCE 、NMR 等)相结合技术,构建中药及其复方复杂体系的吸收、分

布、与靶细胞结合、代谢和代谢组学的体内外研究技术平台,系统阐明中药体内发挥作用的效应成分(群),建立与临床效应相关的、体内真正起效的符合中药多成分、多靶点协同作用特点的中药质量控制方法,构建符合用药实际的中药质量控制新体系。

311　中药复杂体系中小肠可吸收成分(群)研究

方法的建立及其应用

口服给药是最常见的临床给药途径,药物的

和吸收机制。应用这种方法,一些中药成分的吸收情况得以阐明[19223]。其不足是分离分析操作烦琐、工作量大,并且难以一次阐明中药多成分的吸收以及成分之间的相互影响情况。

固定化脂质体色谱模型:1995年Beigi 等[24]首次采用凝胶作为载体利用固定化的脂质体固定相用于模拟小肠上皮细胞对药物的吸收过程。随后,国内的邹汉法等[25,26]对这一方法进行了改进,建立以涂敷磷脂的硅胶为模拟生物膜固定相,用于预测药物的小肠吸收,并且将该技术成功应用于单味中药的研究[27]。本实验室在此基础上,将其应用于方剂中活性成分的细胞膜通透性筛选的研究,并考察方剂中各成分之间的相互影响[28231]。以经方当归补血汤为例,我们应用固定化脂质体色谱技术,对当归补血汤及其组分的总提取物进行了研究,结果显示,当归补血汤提取物经固定化脂质体色谱柱分离后,有14个组分有明显保留,表明这些组分与模拟生物膜具有明显的相互作用,有可能被机体吸收。药物在固定化脂质体色谱柱上的保留受流动相pH 、盐浓度、缓冲试剂、磷脂用量等因素的影响[29];经过改进的固定化脂质体色谱柱还成功地用于同时测定当归补血汤及当归直接提取物中的藁本内酯和阿魏酸的含量[30];以当归补血汤在固定化脂质体色谱柱上有明显保

留的7个成分为考察对象,研究其与动物小肠吸收模型的相关性,结果显示,固定化脂质体与大鼠离体和在体小肠吸收模型均有很好的相关性,其相关系数分别为:019350和019356[31]。用这种方法进行活性成分细胞膜结合能力的评价,可以直接进行分离分析,速度快、重复性也较好,排除中药中存在的大量杂质的干扰,提供中药中可经机体吸收成分的重要信息,可作为一种研究中药中经小肠吸收成分的有力手段。

固,的特点,以中药提取物(有机整体)为对象,采用高效液相色谱技术,分离、分析比较方剂提取物直接透析后与中药提取物与模拟生物膜(脂质体)混合物透析后其中所含各种物质峰面积的变化,其中峰面积显著减少的峰则是与模拟生物膜(脂质体)有作用的成分,应用在线的LC/MS 等技术鉴定这些成分,就可从复杂的中药体系中筛选出能与模拟生物膜(脂质体)结合的成分[32235]。我们以当归补血汤及其组分的总提取物为研究对象进行了研究[34,35],结果显示,当归补血汤直接提取物中有50余个峰,通过HPLC 2DAD 2ELSD 联用检测生物样

品,其中15个峰与模拟生物膜具有明显的相互作用,采用LC 2MS 技术和标准品对照的方式,对15个成分的结构进行了全部鉴定,并初步作了通透性能力评价,鉴定这些成分中包括藁本内酯、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮等,与文献报导当归补血汤中的活性成分具有很好的一致性。此外,HPLC 2DAD 2ELSD 联用技术非常合适方剂复杂体系的研究,DAD 灵敏度相对要高,可用于有紫外吸收和挥发

性化合物的检测,如当归补血汤中阿魏酸、藁本内酯、黄酮类成分等,而ELSD 则用于无紫外吸收化合物的分析,如皂苷、环烯醚萜、脂肪酸类等,二者互补,为中药和复方中复杂的化学成分提供全面的信息[36]。总之,脂质体平衡透析2高效液相色谱

Caco22模型:小肠是吸收的主要场所,肠内上皮细胞屏障及酶系统是吸收的主要屏障。Caco22细胞模型是最近十几年来国外广泛采用的一种研究药物肠吸收的体外模型,许多文献均支持Caco22细胞模型与整体吸收良好的相关性[37],在吸收过程研究中,比较简单,重复性较好,应用范围较广,是研究药物吸收机制、预测体内吸收和药物相互作用、新药设计及评价药物生物利用度及安全性的良好工具。

本实验室用Caco22模型筛选中药及其复方中具有Caco22细胞渗透性的成分,以当归补血汤、银花甘草汤、丹参等[38,39]为例,对其活性成分作初步的筛选。如建立HPLC2MS方法和改良的Caco22细胞模型研究丹参中可吸收成分的方法,并与大鼠在体灌流给药后的血浆中的成分相比较,结果表明,在加药Caco22细胞破碎液中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B7种丹参的成分,给药后大鼠血浆中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A共8种丹参的成分。由此可见,本实验所采用的Caco22细胞筛选中药中的可吸收成分的方法是有效的,为复杂体系的中药的效应物基础研究提供了一个新方法。

312　中药复杂体系中与血浆蛋白结合成分(群)研究方法的建立及其应用

药物与血浆蛋白的结合,保障了药物随着血液循环到达靶标发挥作用。因此中药及其复方中成分与血浆蛋白具有适当的结合系数是药物发挥全身作用的前提。邹汉法[40,41]等以血浆中两种主要的运载蛋白:人血清白蛋白(HSA)和α2酸性糖蛋白(AGP)为固定相,对常用中药当归、川芎、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等进行了分析,结果表明:当归中的阿魏酸、藁本内酯,川芎中的川芎嗪、阿魏酸、正丁基苯酞,茵陈中的茵陈色原酮、滨蒿内酯,丹参中的丹参酮A等已知有效成分均在固定化血浆蛋白色谱中有明确的保留。为了适应中药研究,本实验室建立了微透析取样技术与色谱、质谱连用的方法[42244],研究中药复杂体系中与血浆蛋白结合成分(群)及其成分间的相互作用。

微透析是一种连续的、不间断的取样手段,可对组织中的药物进行实时动态监测。另外由于微渗析探针膜的分离作用,大分子的机体内源性物质不能进入渗析液,样品相对纯净,不需要繁琐的样品前处理工作,可实现与HPLC2DAD/ELSD、LC2 TOF/MS、HPCE、LC2NMR等在线进样分析,适合研究中药复杂体系中多成分与血浆蛋白的相互作用。我们实验室成功运用所建立的方法用于当归补血汤中多成分与牛血浆蛋白的结合筛选[44],从当归补血汤提取物中筛选出10种与牛血浆蛋白具有适当结合系数的成分,并比较了8个化合物单独与血浆蛋白作用和在复方中结合系数的差别,结果表明中药的多成分、协同作用的特点。313　中药复杂体系中与靶细胞结合成分(群)研究方法的建立及其应用

现代药理研究表明,中药发挥作用的一个重要步骤是与靶细胞或细胞内特异性的酶或受体结合,因而,与靶细胞结合也是中药发挥作用的关键步骤之一。贺浪冲等[45]将活性细胞膜(血管内皮细胞、心肌细胞)固定在硅胶表面,制备活性细胞膜色谱,用于筛选当归、红毛七、淫羊藿、太白花等中草药中的有效成分,取得了一定的进展。与传统的方法比较,生物膜色谱技术以中药直接提取物为研究对象,测试受试药物与细胞膜的结合情况再进行分离,排除了中药中存在的大量杂质的干扰,因而很好地反映了中药成分的多成分、多靶点的作用特点。其不足之处是类同于固定化脂质体色谱和固定化血浆蛋白色谱,并且由于细胞膜容易失活,因此色谱柱的使用寿命更短。

本实验室建立了活性细胞固相萃取———色谱、质谱联用技术用以筛选中药复杂体系中与靶细胞结合成分(群)。该技术以活性细胞为分离载体[46248],以中药提取物(有机整体)为对象,提取物中的成分依据与细胞是否具有特异亲和能力而分离。采用高效液相色谱技术,分离、分析比较方剂提取物与细胞结合前后生物指纹图谱峰面积的变化,分析细胞破碎液中活性细胞可吸收成分,应用在线的LC/MS等技术鉴定这些成分,就可从复杂的中药体系中筛选出能与活性细胞有相互作用的成分。我们以内皮细胞为活性细胞,应用该技术对当归补血汤及其组分的总提取物进行了研

究[48],结果显示,当归补血汤提取物中5

内皮细胞具有特异性的相互作用,采用LC

术和标准品对照的方式,

本内酯、毛蕊异黄酮等

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基因时代的必然产物和新兴学科,它也是系统生物学的关键技术和研究方法。国外在2005、2006年出版的几本有关中药方面的著作及本实验室在2006年出版的《现代生药学》中均提及代谢组学在中药研究中的重要作用[49251]。代谢组学创始人、英国帝国理工大学的JeremyNicholson教授认为,代谢组学与有着几千年历史的中医药学在许多方面有相近的属性,它们的有机结合研究将有力推动中医药理论的现代化进程。

从系统生物学的角度看,生命体所产生的疾病是因其基因调节和蛋白质网络被”扰动”而致,这一被“扰动”可通过生命体分泌的体液中内源性代谢物组的改变而反映出来。中药(尤其是复方)进入生命体后,起效的是中药中的原形成分或代谢产物,或与机体作用形成的新成分,三者构成体内中药成分的代谢物组。而中药代谢物组通过多靶点、多系统,协调干预人体内源性代谢物组来治疗疾病。

内源性代谢物组是基因———蛋白———新陈代谢产物这样一个生命活动链的终点集合体,所反应的就是疾病、中药对生命体作用所产生效应的最终结果和表现,这与中医中药的哲学思想十分吻合。任何外源物质、病理生理变化或遗传变异的作用都会反映到各种生物学途径上,对内源性

代谢物质的稳态平衡产生干扰,从而使内源性代谢物中的各种物质的浓度和比例发生变化。相反,内源性代谢物组的变化是通过中药体内代谢物组的变化而引起的,追踪中药体内代谢物组的组成和变化,阐明其引起内源性代谢物组变化的关系,可以证实中国传统中医中药的疗效,阐明中药作用的机理,并解决中药现代化的瓶颈———中药效物质基础的阐明。

由此可见,生命体———疾病———中药作用,环

体———疾病———中药这个有机系统,一方面,通过“绘制”代谢物组网络图,研究生命体代谢网络在疾病和中药(如当归补血汤、丹七方等)干预下,所引起的内源性物质代谢的变化或随时间的变化;另外一方面,把中药作为一个有机的整体,对中药成分在体内的代谢变化情况进行动态跟踪检测、定量和分类。比较正常、病理、服用中药后生命体代谢网络图谱差异,借助于化学计量学等手段,将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件、中药提取物中的有效成分关联起来,从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点,进而确定相关的生物标志物(组),认识疾病的本质;证实中国传统中医中药的疗效;找出中药提取物中的“关联”成分(群),揭示中药成分结构-代谢-活性的相关性;阐明中药药效作用机理和效应物质基础。

本实验室对丹七方的体内代谢物组进行了系统研究[52,53]。采用高效液相色谱———电喷雾离子阱质谱法,能够高效的分离、灵敏的检测和全面的鉴定复方丹参方中多类成分及其在家兔和小鼠的血浆、尿和粪便中的多种代谢产物。复方丹参方中三七和丹参的多类成分在家兔、小鼠体内的代谢情况存在较大差异,三七皂苷类成分可原形存在或脱去糖链后形成含1个葡萄糖的皂苷及皂苷元;丹参酚酸类成分不以原形存在,而会发生羟基化,或与葡萄糖醛酸、硫酸形成结合型代谢产物;丹参二萜醌类成分可能仅在同类成分间转化,不

会生成新的成分。本实验方法全面系统的了解复方丹参的代谢物组信息。

相关代谢组学的研究正在进行中。如建立4种不同的血虚证动物模型及代谢谱,并通过与正常动物代谢谱的比较来确定与血虚相关的生物标志物,解析当归补血汤组(给药组)的代谢谱,研究其对生物标志物的影响,如使某些标志物含量增高或降低等。由于这些生物标志物都是由某种或类特定的细胞或受体所释放,因此可将标志物提供的信息结合药物成分的构效关系来阐明当归补

特点的效应物质基础,采用生物指纹图谱、代谢指

纹图谱与多活性指标成分定量分析相结合的,与体内疗效直接相关的中药质量控制新体系。并将这一思路成功的用于包括金银花、黄芪、当归、丹参、三七等中药材、制剂和复方丹参片、当归补血汤、银花甘草汤、丹七方等中药复方制剂的质量控制研究[36,54260]。例如,效应物质基础实验表明[32,44,46],中药材黄芪的主要药效成分为黄酮类和皂苷类成分,本课题组在对黄芪药材及其制剂

(黄芪颗粒、黄芪精、黄芪注射液)的质量控制研究中,首次运用HPLC 2DAD 2ELSD 联用技术,进行了多指标成分同时定量分析[36]:分别定量了6个主要活性的黄酮类成分和4个主要活性的皂苷类成所示。在对复方丹参制剂的质量标准3类主要活性成分(酚酸、皂苷类成分)同时进行定量分。

图1　中药效应物质基础研究和质量控制方法的新思路

A2B10

个标准品的HPLC2DAD2ELSD色谱图;C2D黄芪药材的HPLC2DAD2ELSD色谱图峰126为黄酮类成分,7210为皂苷类成分

图2　HPLC2DAD2ELSD联用技术提高黄芪药材的质量控制模式

4　结　语

中药效应物质基础的阐明和科学的质量控制方法的建立是中药现代化、产业化和国际化的关键。本文以中药的整体观和多成分、多靶点协同作用特点为切入点,充分考虑中药体内过程中化学成分的变化,综合运用多学科知识和现代先进的分离分析手段,构建中药及其复方复杂体系的吸收、分布、与靶细胞结合、代谢和代谢组学的体内外研究技术平台,并结合化学指纹图谱、生物指纹图谱和代谢指纹图谱,实现中药效应物质基础的现代化学、药理学、细胞学和分子生物学等多学科方法的表达。进而探索其效应物质基础、代谢过程及作用机理,创建效应物质基础的现代研究体系。在此基础上,建立与临床药效相关的、体内真正起效的、符合中药多成分、多靶点协同作用特点的中药质量控制方法,构建符合用药实际的中药质量控制新体系。该体系对于中药效应物质基础和作用机理、中药方剂配伍规律及中药创新药物的研究和开发具有重要的指导意义;对于让全世界更多的人了解中药理论的实质,促进中药走向世界,弘扬中华民族灿烂的中医药文化也具有重要的意义。

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MethodsfortheElucidationofBioactiveComponentsand QualityControlofTraditionalChineseMedicines

LIPing3,QILian2Wen,WENXiao2Dong,SHENGLiang2Hong

KeyLaboratory of Modern Chinese Medicines,Ministry of Education and Department of Pharmacognosy,China Phar2 maceutical University,Nanjing210038,China

【ABSTRACT】　Theelucidationofbioactivecomponentsandestablishmentofscientificqualitycontrolmethodsareveryimportanttothe modernization,industrializationandinternationalizationoftraditionalChinesemedicines(TCMs).BasedonthetheorythatTCMsexpress theirbioactivitiesbyspecialcharacteristicsofsynergisticactionofmultiplecomponentsandmultipleactingsites in vivo,thebioactivecom2 poundsofTCMswereelucidatedbycharacterizingthephysiologicaldisposition in vivo ofTCMs,includingabsorption,distribution, metabolismandtheabilitytocombinewithpeculiarreceptororcells.Then,animprovedqualitycontrolmethodwasestablishedthrough analysisofbiologicalfingerprintsandsimultaneousdeterminationofmulti2bioactivecomponents,whichisinaccordancewiththespecial actingcharacteristicsofcomplexTCMs1

【KEYWORDS】　QualitycontrolofTCM;Bioactivecomponents;Physiologicaldisposition;Absorptionanddistribution;Metabonomics

【FoundationItem】　ThisprojectwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30530870;No.30472160), andDistinguishedYoungScholarsFund(No.30325046)

中国天然药物　2007年1月　第5卷　第1期Chin J Nat Med　Jan.2007　Vol15　No11　9