HE染色操作

摘  要：HE是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）的首个字母缩写。苏木精是碱性染料，使细胞核染色质和胞质内的核糖体呈紫蓝色。伊红是酸性染料，使细胞质和细胞外基质中带较强碱基的蛋白质成份着红色。通过本实验掌握石蜡切片HE染色技术，探讨一种适合动物材料的最佳HE染色方法。我们分别用不同固定液固定兔颈总动脉，用不同HE染色方法染色，比较不同方法的效果。染色结果是细胞核与细胞浆呈蓝红相映，色泽比较鲜艳。改良Harris法染色效果最好，染色效果受组织病理变化情况影响，有个体差异。

关键词：HE染色；改良Harris法；改良Lillie-Mayer’s法；改良Mayer法；

1  引言

在病理学实验课中，要观察大体标本和镜下标本，为了能更好的掌握实验课中所学的知识和内容，尤其是镜下标本，熟悉病理组织的制片技术是非常重要的，这对能否看好切片有很大帮助，它是教学、医疗、科研中必不可少的重要组成部分。

染色原理和机制尚无定论，处于学说阶段。可能既是化学反应，又有物理作用参加。从化学角度看，动物或植物细胞内，一般有酸性和碱性部分的区分。含有酸性物质的部分能与溶液中的阳离子结合，含有碱性物质的部分能与溶液中的阴离子结合。例如细胞核，特别是核内的染色质，一般认为是酸性物质组成的，其中主要是核酸，故它与碱性染料的亲和力很强，易于染色，例如氧化苏木素铬盐因为碱性燃料中的碱性部分有染色作用的是阳离子，而细胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料的亲和力很大易于染上它的颜色，如伊红，因为是酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子，所以细胞核为碱性染料苏木素所染，细胞浆为酸性染料伊红所染。细胞内核的染色质、粘液和软骨的基质多染碱性染料。但必须注意的是，嗜碱性和嗜酸性是相对的而不是绝对的，若细胞在盐基性染液内置留过久，胞浆也可着上盐基性染料的颜色。相反，若细胞浆在酸性染液内置留过久，胞核也能着色。从物理角度看，在染色过程中，染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内，此时，因受到分子的引力作用，色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可显出来不同的颜色来。

本实验主要针对常规HE染色方法的不足，从固定剂的特性、用量、染色剂用量和染色方法、染色条件等几个方面加以调整和改良，找出效果比较理想的切片染色方法。实验采用苦味酸和两种方法来固定，改良Harris法、改良Mayer法、改良Lillie-Mayer’三种HE染色方法, 两种伊红染液（0.7%酸化伊红和0.5%水溶性伊红染液）进行实验。

2  材料及方法

2.1 实验材料  新西兰大白兔两只，分别为2.8kg和2.7kg。

2.2 主要试剂  70%酒精，80%酒精，95%酒精，无水酒精，蒸馏水，苦味酸，苏木素，硫酸铝钾，红色氧化汞，冰醋酸，甘油，碘酸钠，钾明矾，浓盐酸，碳酸氢钠，硫酸镁，二甲苯（固定液），伊红Y ，1%稀氨水，浓度为10％的甲醛固定液，石蜡，试剂均为分析纯。

2.3用品与仪器  烧杯（1000ml  100ml 50ml），量筒（1000ml 10ml），漏斗，滤纸，玻璃棒，移液管，洗耳球，载玻片，盖玻片，滴管，镊子，解剖刀，标签纸等。仪器见表1所示。

表1 主要仪器型号表

2.4 实验方法  将新西兰大白兔通过注射空气致死后，进行颈部解剖手术分别取其左右颈总动脉，用苦味酸和两种方法来固定，并进行改良Harris法、改良Mayer法、改良Lillie-Mayer’三种HE染色方法的改良实验，最后用倒置显微镜进行镜检观察分析。

3  实验步骤流程

实验的具体方案见表2：

表2  HE染色实验方案

3.1  组织的取材与固定 

取材是根据实验的目的和要求以及病变的程度而合理取得的组织材料。取材的正确与否直接影响到病理诊断的结果。固定是将需保留制成标本的脏器或病变组织，浸入固定液内，使组织的形态结构与生前相仿，组织细胞的物质成分变为不溶性，从而得到保存。同时使组织硬化，利于切片；使组织产生不同的折光率便于观察；某些固定液有助染作用，利于切片染色。组织取材应注意以下几点：

l）及早取材，愈新鲜愈好；

2）取材刀要锋利，宜一刀切平；

3）活体小块组织要包好，以免丢失；

4）为区别脏器的不同部位可将组织分别切成不同形状（三角形、方形、梯形等）；

5）取材后要标记检验号，以防混乱造成差错；取材后剩余组织应保留，以便复检、特染、教学和科研之用。

3.1.1 固定液的配制

1、饱和苦味酸溶液（共配200ml）：100ml蒸馏水中加入苦味酸约1.5克，制成饱和水溶液。

2、0.1mol/LPBS缓冲液：19mlA液和81mlB液混合再加至200ml即为0.1mol/L缓冲液：

A液：  3.12g，至100ml蒸馏水

B液：N HP ·12 O 7.16g，至100ml蒸馏水

3、10%中性固定液（共配200ml）：10ml甲醛加入90ml浓度为0．1mol/L PBS

3.1.2 手术取材

将两只大耳兔进行注射空气法致死后，进行颈部解剖手术分别取其左右颈总动脉，用苦味酸和两种方法来固定。固定过程中用摇床振荡，大约12小时。其手术情况见图1和图2，取材实验记录见表3。

图1 手术前实验准备

图2 颈总动脉取材过程中

表3 取材及固定记录表

3.2        脱水及透明 

脱水是应用脱水剂将组织内的水分置换出来，以使石蜡均匀地渗透到组织中，同时组织又不出现收缩变形等人工改变。我们选择酒精为脱水剂：脱水力较强，因为浓度高时易使组织过度硬化，所以一般从低浓度开始，逐渐递增其浓度，直至无水酒精。

透明是组织经脱水后，用能与脱水剂及石蜡混合的试剂，将脱水剂置换出来，使石蜡均匀渗透进去，有的透明剂可使组织呈透明状态，故称透明。二甲苯既溶于酒精又溶解石蜡，我们选择其作为透明剂。

3.2.1 溶液配制

75%乙醇     400ml

85%乙醇     400ml

95%乙醇     800ml

1:1的无水乙醇二甲苯   400ml

3.2.2 脱水步骤  

首先用流水冲洗固定后的组织30min，开始以下脱水步骤：75%乙醇（2h）→ 85%乙醇（2h）→95%乙醇（2h）→95%乙醇（2h）→100%乙醇（2h）→100%乙醇 （2h）

3.2.3 透明步骤

1∶1无水乙醇二甲苯（30min）→二甲苯（30min）→二甲苯（30min）

3.3 浸蜡及包埋

浸蜡是组织经透明后，置入熔化的石蜡中浸渗，约为1小时，共三次。浸蜡的目的是将石蜡均匀浸渗至组织中，使组织的硬度与石蜡的硬度相似，利于切片。浸蜡后的组织用包埋框将其包埋。包埋用蜡的熔点（47.5℃ ）要与最后一次侵蜡的石蜡熔点相一致，这样有利于切片。

3.4 切片、粘片及烤片  

切片是将组织标本制成很薄的片子，以便染色后，在显微镜下能观察细胞的形态结构和病变情况，是制片中的重要一环。切片方法是：将切片用具备好，修正并固定好包埋蜡块，即可切片。切片厚度一般为6μm左右（本实验因切片机问题选择8~10μm），将切出的片子放在水浴锅中展开，然后用粘片剂粘在预先用酒精处理了的载波片上，经过37.5℃恒温箱中烤片2h后即可进入染色。

3.5 HE染色程序  

染色是组织标本制成切片后，为了观察和鉴别其形态结构或物质成分有无异常，用适当的染料进行染色。组织不同着色不同，深浅不一。苏木素本身无染色能力，必须在媒染剂的作用下经氧化为苏木红才具有染色作用，用于细胞核染色。伊红Y 用于细胞浆染色。还可显示细胞的嗜酸性颗粒，故将这种细胞颗粒称嗜伊红颗粒。

3.5.1 染液的配制

1、改良的Harris苏木素液：200ml

A液：苏木素1g      无水酒精 10ml

B液：硫酸铝钾20g   蒸馏水 200ml

步骤：两液分别溶解后混合，加热煮沸后，徐徐加入红色氧化汞0.5g，此时有大量气泡产生，故容器宜大，以防液体溢出，然后将染液迅速冷却，过滤后每100ml加入冰醋酸6ml，并加入甘油（丙三醇）10ml。

2、改良Lillie-Mayer’s苏木素

苏木素0.25g，无水酒精2ml，硫酸铝钾0.5g，蒸馏水33ml，碘酸钠25mg，甘油15ml，冰醋酸1ml

3、改良的Mayer苏木素染液

A液：苏木素1g  无水酒精20ml

B液：钾明矾50g  蒸馏水300ml

AB两液分别溶解后混合，煮沸3-5分钟加入蒸馏水至1000ml，最后再加入0.2g碘酸钠。

4、0.7%酸化伊红染液

伊红Y4g，蒸馏水100ml，95%酒精200ml。取伊红Y4g，溶于100ml蒸馏水内，加浓盐酸2ml，用玻棒搅拌均匀，使其变黄沉淀，放置24小时后，用滤纸过滤，待液体全部滤净，再取蒸馏水10ml，置入滤过容器内冲洗滤出物。连续冲洗3次，将滤出物连同滤纸一起放入60℃干燥箱内烘干，将烘干的滤出物溶于95%酒精200ml内，制成酸化伊红饱和溶液，室温存放备用。用时取饱和溶液1份加上95%酒精2份，配制成0.7%酸化伊红酒精染液。

5、0.5%水溶性伊红染液

取伊红Y0.5g，蒸馏水100ml。先用20ml蒸馏水溶解伊红，全部溶解后加入全部80ml蒸馏水。最后加一滴冰醋酸。

6、1%盐酸-酒精分化液

浓盐酸0.5ml，70%酒精45.5ml

7、Scott促蓝液

碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100ml

8、1%稀氨水

9、25%氨水20ml，470ml蒸馏水

10、80%乙醇

3.5.2 脱蜡处理

二甲苯（3次，每次10min）→100%酒精（3次，每次5min）→95%酒精（1次，10min）→80%酒精（1次，10min）→蒸馏水（2次，每次5min）

3.5.3 开始染色处理

苏木素染色（12min）→Scott促蓝液冲洗（1min）→1%盐酸酒精分化（20s）→Scott促蓝液洗（1min）→1%稀氨水返蓝（30s）→ Scott促蓝液洗（1min）→用0.7%酸化伊红染液和0.5%水溶性伊红染液分别染色（30s）

自来水冲洗后立即进行以下处理：

80%酒精（5min）→95%酒精（5min）→100%酒精（2次，每次5min）

染好的切片放在载玻片盒里暂时储存，以便后面镜检观察。

3.6 进行镜检

学习使用倒置显微镜后，在镜下逐渐放大观察，并对较好的染色片子进行显微拍照。