HE染色资料介绍

一、染色目的

病理学的所有切片，都必须通过一种以上的染料，通过各种不同的方法，将切片中各种不同的物质，在不同染液的作用下，将其显示出来，使之在光学显微镜下，能够完全的观看各种结构。例如，HE染色，好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构，细胞核着蓝黑色，细胞浆着粉红色，软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据，因此，染色技术也是病理技术中的重要组成部分，必须不断地总结，方能提高。如果染色不好，切片染色一团糟，红蓝不分，结构不清，层次不明，影响了镜下的观察，直接影响了临床诊断，染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。

二、染色的作用

1．化学作用：所有的染色液中，可把它们分为两种类型，一种为酸性，另一种为碱性。酸性染料中有染色作用的为阴离子，碱性染料中有染色作用的为阳离子，每个细胞也存在着两种物质，细胞核含的是酸性物质，细胞浆含的是碱性物质。在染色时，细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用，细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用，由于反应的部位不同，结果着色有异。

2．物理作用：在染色过程中，染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内，此时，因受分子的引力作用，色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可显出来不同的颜色来。

一般来说，染色的学说还有许多，但说服力强的仅有上述两种。但不管怎么样解释，实际上完成的每一种染色，都与上述两种学说分不开，它们的作用是相辅相成，同时存在的。

三、染色方法及步骤

1．人工苏木素-伊红染色法（HE法）

(1)切片浸入二甲苯中5-10min；

(2)切片浸入二甲苯中5-10min；

(3)100%酒精1min。

(4)100%酒精1min。

(5)95%酒精1min。

(6)95%酒精1min。

(7)90%酒精1min。

(8)80%酒精1min。

(9)自来水洗1min。

(10)浸入苏木素染液浸染10-15min。

(11)自来水洗30second-1min。

(12)1%盐酸酒精分化30second。

(13)流水冲洗15min以上。

(14)1%伊红酒精染3-5min。

(15)90%或95%酒精分化30sec。

(16)95%酒精30sec-1min。

(17)95%酒精30sec-1min。

(18)95%酒精30sec-1min。

(19)100%酒精1min。

(20)100%酒精1-2min。

(21)碳酸二甲苯1min。

(22)二甲苯1-2min。

(23)二甲苯1-2min

(24)二甲苯1-2min。

(25)中性树胶封固。

结果：细胞核被染成深蓝黑色；细胞浆被染成粉红色；软骨及钙盐被染成蓝色；胶原纤维染成淡粉红色，嗜酸性细胞及嗜酸性颗粒呈鲜红色；弹力纤维呈淡粉红色；某些蛋白性物呈粉红色等。

染色时的注意事项：

1.切片用二甲苯脱腊，应视不同的季节有不同的脱蜡时间，在夏天，室温较高，脱蜡较迅速，往往在2-3min就可脱蜡干净，二在冬季，时间应相对延长。

2.切片在进入二甲苯前，可用电吹风吹切片，使切片上的蜡处于熔解状态，这样脱蜡较迅速，尤其是冬天，此法更可行。

3.切片上的蜡一定要清除彻底干净，否则将影响染色，造成切片染色不均的现象。

4.切片进行无水化处理，这一步骤，一是可增加切片的附帖，二是可延长苏木素的使用寿命。切片用二甲苯脱蜡后，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，必须经过酒精，酒精可溶解二甲苯，又能与水混合，按照以前教科书的要求，切片在整个染色过程中，都不要让其干燥。经过多年的实践及经验，笔者认为，切片用酒精将二甲苯彻底消除后，在进入苏木素染液前，可用电吹风吹干，这一步对于切片没有充分的烤片时间，对于血块等的切片来说，尤为重要，切片经此步骤，增加了附贴的牢固性，减少切片在染色过程中脱离载片的机会，保证了染色的成功率。另者，切片进入苏木素染液全无水，可保证了苏木素染液的浓度和PH值，延长其使用寿命。以往切片进入苏木素染液前，都须经水洗，每次染色，都带入不少的水分，稀释了苏木素染液的浓度，改变了它的PH值，使染液寿命缩短。

5.切片无水化除了用电吹风外，还可用火烧，切片用90%酒精洗后，取出切片，用火轻烧，也可达到切片的无水化。火对切片有损害吗？否，经实验证明，切片火烧时最高温度为80℃左右，对切片没有影响。用火烧时必须彻底清除二甲苯，因为二甲苯燃烧时可产生浓烟，如果存留于切片，将会影响观察。当然，用火时应特别注意防火，因为病理技术室的大部分试剂都为易燃品。

6.苏木素染液中的最佳染色时间，确切地回答还是比较困难的，因为各种组织都有不同的染色时间，核的染色时间从30sec至15min不等。对于核的染色，为了充分地显示各种核染色质，一定要过染，尤其对于初学者来说，更是如此。

7.苏木素染液有多种，常规应用的通常为明矾苏木素，明矾苏木素又有Harris苏木素，Mayer’s苏木素，和Ehrish苏木素等。

8.盐酸酒精分化切片，浓度有0.25%,0.5%和1%根据各人的情况而使用。这一步主要是将过染的颜色及不该染的染色去除掉，这一步要掌握得当，必须靠经验，核的染色清楚与否靠分化这一招，分化过度，核染色淡，分化不足，核染色质一团，分不清。初学者应于显微镜下控制分化程度。

9.水洗蓝化，也可用温热水来促使切片蓝化，可用氨水，碳酸锂等化学药品来促蓝，虽然如此，自来水冲洗蓝化切片是最好的，这对于切片的保存较为有利。

10.伊红酒精浓度有0.25%,0.5%和1%之分，根据各单位的情况而定。切片一放入伊红染液，即可马上着色，但是，要染好切片，必须染够染足时间。

11.分化伊红须用浓度较高的酒精，以往伊红染色以后，用低浓度的酒精分化，洗去多余的染液，实践中发现低浓度的酒精褪色能力特强，如果掌握不好，染上的伊红，便会被褪去大部分。改用较高浓度酒精后，这种现象便不会出现。

12.作为切片脱水剂的酒精，要经常更换，尤其是无水酒精，更要保持其无水性。否则切片脱水不干净，含有水份就会褪色。切片取出后，不能令其干涸，即刻进行下一步。

13.碳酸二甲苯，对于南方地区来说，是一种很有用的试剂，碳酸吸水性强，用它可加强脱水，它是二甲苯与酒精之间的缓冲剂，切片经此试剂后更加透明和光亮。有人认为碳酸为一种弱酸，切片用它后可能会褪色，这种担心是多余的，切片褪色，最主要是切片本身含有水份所导致。根据我们的实验，82年的切片经碳酸处理后，17年来颜色仍然保持鲜艳就足以说明。

14.二甲苯须换三次，以确保切片的透明度，这对于切片的观察和保存，都大有好处。

15.封片时要做到：切片从二甲苯取出后，不使切片干涸。如果干涸，由于空气潮湿，封片时就保证不了切片的无水。如果切片上保留着一定量的二甲苯，二甲苯的特性不溶于水，它的存在使切片与空气隔开，切片无法跟潮湿空气接触，就可保证切片的无水，这时及时滴上中性树胶，切片就能完好地封好。

16.封片用的中性树胶，不能过稠，也不能过稀，过稠胶难以伸展开，并容易产生气泡，影响封片的速度。过稀是因胶中含过多的二甲苯，封完切片后，胶一收缩及二甲苯挥发，切片就不能被完全封盖上，这都影响切片的质量。

2、自动染色机染色方法及步骤

    自动染色机应用于病理切片的染色是近几年的事情，目前国内仅有少数单位拥有自动染色机，南方医院自1997年引进英国Shandon公司研制的Varicstain TM xy多程序全自动染色机以来，已完成活检HE染色和脱落细胞染色。

应用该机染片的优点

①该机全部由电脑控制，可设置20种操作程序，任意设定各种时间。

②有21个装试剂的罐，其中2个为自来水冲洗罐，切片前水洗和苏木素染色后水洗及盐酸分化时的水洗，都在这两个罐中进行。

③该机配有多种不同的染色架，根据工作量的不同，自行选择，其中最大容量为6张切片。

④该机设置自动操作手臂，可在设置的范围内朝不同的方向和位置到达任何一个染色罐，朝上下活动。

⑤染色罐可多套配备，作多种染色，如组织学的HE染色，细胞学的巴氏染色等。

根据我们的应用情况，现将我们的染色程序列表如下：

自动染色机工作程序一览表

①表中二甲苯的脱蜡时间，可根据季节不同，可随意更改。

②由于为机器操作，切片无法作无水化处理，因此切片在入水洗前要充分去二甲苯。

③切片入苏木素染色前必须水洗，但在表中没有专门供这一次水洗的罐子，在表里21号中注有（6+1）的字样，在程序输入时必须将其输入，否则将没有冲洗这一步。因为整个染色过程，需要三次水洗，而机器的固定水洗罐只有两个，因此罐的使用可以重复使用。

④机器虽然在每一步中，在进入下一罐前设有一定的时间，目的是将试剂控干后再进入下一个缸，虽然如此，还是带一定的试剂进入下一缸。

⑤苏木素要经常观察，发现染核不好，就必须马上更换，因为水洗后的切片可带入水份染液，可稀释染液的浓度。

⑥苏木素最好设置在靠近水洗缸的旁边。如果设置在远离水缸的一边，当要水洗时，由于切片从提蓝中提起，经长途输送方能到达水缸，虽然切片有控干的时间，但仍不够，还会有些许染液滴下，这样会污染机器。

⑦切片脱水用的100%alc也可设置两个缸，根据实际情况使用。

⑧碳酸后所设置的三个缸为二甲苯，目的是使切彻底得到透明，当然两个缸也可以，但效果没有三个缸的好。

⑨切片经一个程序完结后，搁置在所设置的二甲苯最后一缸，如没有去妄动它，它将永远不起来。

3．酒精灯加温快速染色法及步骤

该法可用于临床快速冰冻切片，快速石蜡及某些快速诊断的切片。它不象常规染色法那样，各种步骤都需要一定的时间。快速染色不但要求要快，而且染色质量要好，否则将给诊断造成困难。

①所有切片包括冰冻切片和石蜡切片都须用电吹风吹，使切片附贴牢固。石蜡切片还须经过快速脱蜡，切片经电吹风吹一定时间后约（1min左右），即刻浸入二甲苯，此可见成片的石蜡溶解于二甲苯中，取出切片再用电吹风吹，然后再浸入二甲苯，如此反复2-3次，石蜡即脱干净，酒精洗后，继用电吹风吹干。

②用滴管滴染苏木素染液于切片上，在酒精灯上加热染色。加热时要来回移动切片，不要在一个点上加热，否则染色不均匀，一点加热的地方容易将切片掀起来，导致切片脱离载片。当加热的苏木素染液有蒸汽出现时，即可停止染色（时间约为30sec-1min）。

③倾去余液，急洗，速分化，水洗。将切片浸入70℃左右的热水中返蓝约30sec-1min。

④速染伊红，切片浸入伊红液即可，后速往下酒精至切片封固，整个染色过程约4min左右，其结果与常规法同。

4．超声波快速染色法及步骤

①切片处理同3法①。

②用一小烧杯，将入苏木素染液，浸入超声波的工作范围内，开动超声波计时表30sec，染色即可完成。

③取出切片，速水洗，分化，浸入热水或于超声波工作范围内超声20sec，速染伊红直至封片。

结果同常规染色法

两种快速染色法染色时的注意事项：

①切片要附贴牢固，薄切片是很重要的，如果切片过厚，加热染色时，切片容易翻起脱离载片，导致染色失败。

②超声波快速染色原理见（超声波快速石蜡制作程序）。

苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining )，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。 

染色分类

　　易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )。 

　　组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。 

　　去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。 

　　由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。 

染色结果

　　细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。 

　　着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

常规HE染色步骤

（1）二甲苯（Ⅰ）                             5-10 min

（2）二甲苯（Ⅱ）                             5-10 min

（3）95%乙醇（Ⅰ）                           1-3 min

（4）95%乙醇（Ⅱ）                           1-3 min

（5）80%乙醇                                 1 min

（6）蒸馏水                                   1 min

（7）苏木精液染色                             5-15 min 

（8）流水稍洗去苏木精液                       1-3 s

（9） 1%盐酸乙醇                               1-3 s

（10）稍水洗                                   10-30 s

（11）促蓝液返蓝                               10-30 s

（12）流水冲洗                                 10-15 min

（13）蒸馏水过洗                               1-2 s

（14）0.5%曙红液染色                           1-3 min

（15）蒸馏水稍洗                               1-2 s

（16）80%乙醇稍洗                              1-2 s

（17）95%乙醇（Ⅰ）                            3-5min

（18）95%乙醇（Ⅱ）                            3-5 min

（19）无水乙醇                                  5-10 min

（20）无水乙醇                                  5-10 min

（21）二甲苯（Ⅰ）                              3-5 min

（22）二甲苯（Ⅱ）                              2-5 min

（23）二甲苯（Ⅲ）                              3-5 min

（24）中性树胶封固

结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。

一、操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 

二、冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

三、冰冻切片的快速染色方法：

① 切片固定30秒－1分钟。

② 水洗。

③ 染苏木素3－5分钟。

④ 分化。

⑤ 于碱水中返蓝20秒。

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦ 脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。 

常规方法：

（1）冰冻切片固定                          10～30 s

（2）稍水洗                                    1～2 s

（3）苏木精液染色（60℃）              30～60 s

（4）流水洗去苏木精液                   5～10 s

（5）1%盐酸乙醇                             1～3 s

（6）稍水洗                                    1～2 s

（7）促蓝液返蓝                             5～10 s

（8）流水冲洗                               15～30 s

（9）0.5%曙红液染色                       30～60 s

（10）蒸馏水稍洗                            1～2 s

（11）80%乙醇                                1～2 s

（12）95%乙醇                                1～2 s

（13）无水乙醇                               1～2 s

（14）石炭酸二甲苯                         2～3 s

（15）二甲苯（Ⅰ）                         2～3 s

（16）二甲苯（Ⅱ）                          2～3 s

（17）中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

封片   切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。

在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。

一、HE染液的配制：

1、 Harris苏木素： 

苏木素精   1g

无水乙醇   10ml

一氧化汞   0.5g

硫酸铝钾   20g

蒸馏水     200ml

苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。

2、0.5%伊红(水溶性)： 

伊红        0.5g

95%乙醇   25ml

蒸馏水     75ml

先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。

3、1%盐酸水溶液：

盐酸      3ml

蒸馏水  297ml 

混匀，白色试剂瓶保存。

4、中性树胶封片剂：

往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。  

我准备做免疫组化，但是所要组织中有骨骼，若要分离将破坏周围软组织和整体组织结构，请问有什么方法脱钙能够较轻影响周围组织免疫组化结果。

目前所用的脱钙法主要见于下列：

1．-间苯三酚液：

浓10ml，间苯三酚1g，通风橱内混合。混合时会产生浓的棕黄色双硫磷烟雾。然后加10% 100ml。

骨组织块5mm厚脱钙时间12-24小时。

优点：该液脱钙速度非常快，大概是所有脱钙液中速度最快的一种脱钙液。

缺点：

（1）细胞核染色很差。

（2）如果脱钙时间太长对组织有较大的损害。

（3）要用5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少24小时。

（4）用化学方法测试不能确定脱钙的终点。

2．水溶液：浓5-10ml，蒸馏水加至100ml。厚度5mm骨组织块脱钙12-24小时。

优点：

（1）水溶液是一种迅速的脱钙液。

（2）对组织损害较少，细胞核着色比-液要好。

（3）组织可直接通过70%乙醇去除酸。

缺点：脱钙时间必需仔细控制防止过度脱钙损害组织。

3．-液：40%甲醛5ml，浓10ml，蒸馏水85ml。5mm厚的骨组织块脱钙时间需要1-3天。

优点：

（1）-液是一种迅速的脱钙液。

（2）该液脱钙的组织比间苯三酚-液细胞核染色好。

（3）可作为紧急活检脱钙用。

（4）该液和5-10%水溶液一样对组织几乎没有损害。

缺点：

（1）该液对细胞核作用较慢，使细胞核着色较差。

（2）要用5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少12小时。

4．Perenyi’s 液：

10%4份，0.5%铬酸3份，无水乙醇3份。

5mm厚的骨组织块脱钙时间需要2-7天。

优点：

（1）该液是一种温和的脱钙液，可能由于铬酸和乙醇的存在可以抑制组织泡软。

（2）细胞核和细胞浆细微结构着色均好。

（3）推荐该液作为常规脱钙使用。

（4）组织脱钙后不需要碱性液中和和流水冲洗。脱钙组织直接移到90%乙醇中。

缺点：

（1）脱钙较慢，因此，紧急情况下不能使用。

（2）用化学方法测试不能确定脱钙的终点。

5．Von Ebener’s液：

饱和水溶液氯化钠 50ml，蒸馏水50 ml，浓盐酸 8 ml。

厚度5mm骨组织块脱钙3-7天。

优点：

（1）细胞核染色相当好。

（2）不需要水洗，脱水时酸就会首先被脱出来。

缺点：使用化学方法测试不能确定脱钙的终点。

6．甲酸液：

甲酸 10ml，10%盐 90ml。

厚度5mm骨组织块脱钙时间需要3-7天。

优点：

（1）脱钙同时可以对组织固定。

（2）对细胞核染色比较好。

（3）推荐用于小块组织和牙齿脱钙。

缺点：

（1）脱钙比较慢，不推荐作为常规标本脱钙使用。

（2）不推荐作为密皮质骨脱钙使用。

（3）要用5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少18小时。

7．三氯醋酸液：

三氯醋酸5g，10%盐95ml。

厚度5mm骨组织块脱钙时间需要5-8天。

优点：

（1）对细胞核染色好。

（2）脱钙之后不需要水洗，酸乙醇可以去除。

缺点：

（1）脱钙作用慢，仅仅推荐用作骨的细针脱钙。

（2）不推荐作为密皮质骨脱钙使用。

8．Flemming’s液：

1%铬酸 15ml，2%四氧化锇 4ml，冰醋酸 1ml。

Flemming’s液虽然是一种固定液可作为微细骨针脱钙用。液体需要新鲜配制，并在容器底部会形成沉淀。脱钙后如果直接通过乙醇可以形成不能溶解的色素。脱钙之后标本必需充分流水冲洗去除过多的铬盐。使用化学方法测试不能确定脱钙的终点。用苏木精染色时细胞核受抑制。

9．AFIP甲酸-柠檬酸钠液：

A液：甲酸25ml，蒸馏水25ml。B液：枸橼酸钠（结晶）10g，蒸馏水50ml。

临用时A液和B液等量混合，每日换1次，因为柠檬酸钠可以和钙离子螯合，具有促进脱钙的作用。

10．蒋维中（Jangweizhong’s）液：

盐酸80ml。甲酸70ml，三氯化钙50g，冰醋酸25ml甲醛100ml，生理盐水900ml。

此液脱钙迅速，0.5cm厚的松质骨6-20小时就可以完成脱钙。对组织影响极小，染色效果好。配制简便，脱钙后不需要用碱性液中和。

（二）螯合脱钙剂脱钙法

EDTA是一种良好的脱钙液螯合剂，它对组织破坏极小，不产生气泡，不影响染色，如果加温至37℃，可以加快脱钙速度。

EDTA脱钙液：

乙二胺四乙酸（EDTA）5.5g，10%中性100ml。

厚度5mm骨组织块脱钙时间需要7-21天。

优点：

（1）经EDTA脱钙的组织染色结果好。

（2）对组织的结构损害小。

（3）用化学方法测试可以确定脱钙的终点。

缺点：

（1）脱钙速度相当慢，不适合常规标本脱钙使用。

（2）脱钙后组织会稍微变硬。

目前脱钙方法很多，介绍三种常用的脱钙方法供你参考：

1. 50%甲酸水溶液：甲酸　50ml，蒸馏水　50ml。

为目前最为理想的脱钙剂，脱钙迅速，一般2－3天，组织损伤小，适于标本较大或要求脱钙迅速时。

2. 5%水溶液：　5ml，蒸馏水　75ml，尿素　数克。

此液脱钙迅速、可靠，一般2－3天完成，但对组织的破坏也较大，临床常用，对精细的科研实验不适用。3. EDTA脱钙液：EDTA　15克，蒸馏水　100ml。

此法是科研、组织化学等较精确的实验最为理想的脱钙液。优点是对组织损害极小，不产生气泡，不影响染色，并可以保护骨组织中的酶类，可用于骨的酶组织化学，免疫组化和原位杂交等。脱钙时间为2周－3月，如需快速脱钙，可加温至37度使用。

如对实验组织要求高的话，建议用EDTA；如要求快速脱钙的话用50%以下的甲酸。

你可用5ml 注射器穿刺抽取骨髓，涂片参考血片涂法，骨髓组织可将骨髓腔切开后取，参考以下步骤：

一、 固定 

目的: (1) 防止自溶；(2) 凝固细胞内的蛋白质、糖、脂肪等；(3) 产生不同的折射率； 

(4) 硬化组织；(5) 对染料产生不同的亲和力;保存抗原成份 

时间：18～24小时 

要求：组织离体后立即固定 

固定不即时可引起蛋白质的降解，引起染色不可逆的减弱或者消失，甚至与非特异无关的分子结合． 

任何组织离体后由于缺血缺氧而发生变性，甚至自溶，***。因此，穿刺的骨髓组织必须立即固定。常用的固定液是10%缓冲中性甲醛。但由于临床上多数用10%甲醛，标本送到病理科后马上换成中性甲醛。固定时间可达18--24小时，至少不少于12小时，但固定时间也不能过长．固定时间不足易造成细胞有关成份弥散，时间过长也可导致抗原成分的破坏，免疫组化常以失败告终。 

二、 脱钙及其处理 

骨髓组织是富含钙盐的组织，必须经过脱钙才能制片． 

脱钙目的:去除组织中的无机钙盐． 

目前常用的脱钙制是酸类脱钙剂，既有单纯的酸类脱钙剂，也有混合的酸类脱钙剂。不论使用哪类脱钙剂，脱钙之前，组织必须充分固定（至少３－４小时），否则易造成组织结构的破坏。最常用的混合酸类脱钙剂是4%盐酸甲醛脱钙固定液: 

37～40%甲醛 10ml

盐酸         4ml

蒸馏水 　    86ml

脱钙时间：2～4小时（具体视组织含钙量而定） 

脱钙“终点”的判断： 

手捏富有弹性，无硬的感觉； 

用取材刀的刀锋轻刮骨髓表面，无明显的沙沙声； 

§ 用大头针轻刺骨髓能顺利通过； 

§ 化学方法：脱钙液5ml+浓氨水1ml+0.5%草酸0.5ml，然后观察有无沉淀，若无沉淀表明脱钙已达终点。 

§ 脱钙完毕后，酒精处理：70%酒精泡2—3小时，期间更换2次酒精。 

§ 目的：防止组织膨胀，增强染色。 

严禁在脱钙液中过夜，否则，将给染色带来影响。如脱钙时间过长，可先用70%乙醇处理，然后再用1%碳酸锂处理，以助着色。 

三、 切片、 

要求和标准：（1）切片平整、结构完整； 

（2）无皱折、无刀痕； 

（3）细胞尽量单层分布，一般情况下 

切片厚2um（尤其是急性髓细胞白 

血病及淋巴瘤累及骨髓的病例）。 

切片的技巧：（1）对角包埋； 

（2）刀口锋利； 

（3）切片时组织块要够冷 

由于血液病患者的特殊性（发热、贫血、出血感染等）及骨髓组织自身的特殊性--组织硬而脆。掌握切片的技巧尤其重要。目前，多数医院的病理科已使用一次性刀片。一次性刀片有其独特的优点，但其韧性和硬度远不如钢刀，一个刀口切上十来个蜡块后，刀锋变钝，蜡片皱缩，若这种情况下切骨髓组织，将出现组织挤压现象。为了确保切片质量，切骨髓组织时最好选用新的刀口，切片既完整又薄，切片厚度约为2um较为合适。若切片过厚，细胞重叠，必将影响医生的诊断。 

四、 捞片 

捞片看似简单，但要捞好每一张片，却要有一定的技巧。当每一张切片摊片时，既要让它充分的舒展（以防皱折），又不能让组织散开（细胞极易弥散），就得靠我们的观察及及时捞贴。另外，对捞片水温的掌握也很重要。骨髓组织合适的捞片水温应为47-480C。骨髓组织因纤维支架少（尤其是增生极度活跃的骨髓组织），水温过低，切片难以展开；水温过高，组织容易散开，其原有的组织结构遭到人为的破坏，对需要计算细胞数目的特殊病变（如再障时计标巨核细胞的数目），此项工作难以进行。 

五、烤片 

烤片尽量采用恒温烤箱烤片，温度为60—620C，烤片时间1—2小时。避免用摊片仪烤片及电吹风吹片。前者易致骨髓组织散开而破坏其结构，后者不易掌握温度，易造成组织烤焦。 

六、HE染色的控制 

采用标准化的染色程序（自动染色机染色）而且单列骨髓染色程序．染色时间：Mayer苏木素 25min 伊红 1min, 人工染色时分化不要过头，每天检查染色质量，以保证切片的完整，无刀痕、振刀；染色鲜艳—核浆对比分明，细胞无固缩、挤压等现象。 

冰冻切片技术

1.从锋利的刀片开始

我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片，当片子的质量开始下降时，我会立刻更换刀片。某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝，因此，经常更换刀片显得很有必要，有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。

2.坐着还是站着

我切片时总是坐在一张凳子上。要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作，从而精细地控制显微厚薄程度的片子。切片时俯身弯腰，颈部过伸的姿势有些不妥，要尽量处于放松和舒适的姿势以便能最大程度控制你的左手。

3.刷子

我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先学会使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到台子上。冷冻的片子会自发的卷缩并从刷子上脱离下来，因此，我使用一把有硬毛、夹取面宽的刷子。我发现来自中国的野猪毛十分坚硬，非常管用。你可以花3美元从工艺店买一把1/4英寸长的#2号扁平无色的刷子，把毛削成一个角度。由于是个有角的头端，加上握持刷子成一定的角度，这样刷子与组织接触时就会象扫帚一样的平。我不能理解为什么有人使用脆弱的骆驼毛刷子，组织片很容易从这些柔软的毛上掉下来。

4.握持刷子

左手象拿笔一样握持刷子，将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方)，这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。我把刷子削成一个角度，大致与左手握持刷子的角度相同，这样使刷子平着接触组织的1/4。

5.摇柄的旋转

以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，且要毫不犹豫。我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动摇柄。依我的经验看来，这种动作增加了起始切片假象的可能，会使片子的厚度不均匀，也增加了处理脂肪类组织的难度。我切片时，象前面所说的那样手握刷子，以一种连续的动作抓取组织，这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。

6.刷子的移动

组织块移向刀片时刷子也要同步地向下移动，当组织块刚好接触刀片时刷子轻轻停在其底部2mm处并迅速抽离。正是刷子的向下移动使你能连续地抓取组织，当开始的几毫米组织穿过刀片时便有自发卷曲的现象，这时，运动中的刷子立刻粘住其游离的边缘部分并水平地拖向切片者。刷子的运动路径是一个朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，连续不断。但要注意有时候把组织压向台面时会使组织粘在台面上，可能会导致碎片，应尽量避免。当然预先将组织包埋起来可以使刷子不用接触到组织，切片也容易多了。

7.贴片

可以从切片机的台面上也可直接从组织块面粘贴组织片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一个角度粘住片子的一角，在静电作用下片子会吸附在玻片上并迅速融化。当然在周围涂一些包埋物对贴片有利，这种多余的包埋物可以保护片子的边缘免受皱缩的损坏。有时候碰到贴片困难，我会在切到最后2mm包埋物的时候停下来，让片子留在组织块上，然后倒转摇柄，使组织块退离刀片，再用刷子从边缘把组织片摊平，这样就可以从组织块面贴片了，这对卷曲的片子或者脂肪组织非常管用。

8.快速固定

我右手转动摇柄也同时拿着玻片，片子一切好，立刻粘起片子并将它浸没于固定液中。固定液需置于方便够到的地方，我一般将染色架放在染色缸的旁边，先将片子置于95%的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上。如果组织固定延迟会出现风干的假象，我的经验是组织片还在切片机的台面时，风干效应很小，当组织片粘在有温度的玻片上时就会出现明显的风干假象，表现为核的细节丢失及胞浆液的溢出。下面几张图片是延迟15秒固定和立刻固定的相同组织的比较，差异非常明显。

9.切片的厚度

对于一般的手术病理我推荐切6um厚，这种厚度使染色更加饱满，层次清晰，病理学家通常在2x 和 4x的放大倍数下可以获得更多的信息。太薄的片子在这种放大倍数下显得苍白，容易忽略一些细节。6um的片子可以有更多的时间去避免风干假象，也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。当然特殊情况下可能需要更厚或更薄的片子。

10.为什么会掉片

我不能确定组织片粘附到玻片的具体机制，但我相信可能与组织内的液体与玻片发生分子交联有关。下面我例出几种染色过程中组织片脱落的情况：

1）本身非常干燥或过度脱水的组织；

2）组织片的周长与面积比过大，象细条形的组织容易受染色缸内液体涡旋应力的影响而脱落，同样包括薄的纤维囊肿及不规则的坏死组织，太厚的组织也不例外；

3）返蓝用的氨水浓度太高；

4）少数情况需要使用100%的乙醇固定；

5）一张玻片贴多个片子时，片子周围的包埋物相互重叠。

组织块的准备

1.调整好组织与刀片的方向

这是冰冻切片准备中极为重要的方面，使用一些包埋物可以使这项工作变得简单，在我的工作中我总结出一些经验可供参考。

a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不够，对绝大多数组织均合适的温度却切不好脂肪组织，如果一刀下去，组织中的脂肪先接触刀片，就会破碎并使整个片子损坏。如果脂肪最后接触刀片，则切片过程不受干扰。最糟糕的情况是脂肪部分先接触刀片而没有包埋物的保护，包埋物可以给片子提供一个起始的缓冲，如果没有包埋，脂肪就会切碎并把整个片子破坏。当切片过程中由于脂肪的出现而影响质量时，我要么把摇柄转回去尽量避免，要么把脂肪挖出来。

b.组织与刀片垂直或成角是关键。让我们假设组织由起始端、中间部分及末尾端三部分构成，起始端容易卷缩，或受到刷子的损害，还可能由于操作者的犹豫而引起片子的厚薄不均，这些都增加了假象的风险。末尾端在贴片时容易拉长，最好的是中间部分，最不可能出现假象，并且组织学上最干净，这是片子中最理想的部分。

非常坚实的组织容易产生横皱，切片时应包埋成角且尽可能的加温。成角包埋就像坐着船冲浪一样，如果你直线行驶，就会承受波浪线上最大的冲击，如果成角行驶，波浪线就会拉伸，所受的颠簸也会减小。跟公路上的减速脊一样的原理。

2.组织块的温度

任何组织都有一个理想的切片温度，在此温度下切片，组织片以平滑均一的形式流过刀片，几乎没有卷缩。当温度、组织类型、刀片均处于理想状态时，切片十分流畅，几乎不用刷子。如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆。如果需要加温，只需要把大拇指置于组织块面几秒钟；如果需要降温，可以使用机子的精确低温包埋系统，简单的做法就是把过冻的冻台放在组织面上几秒钟，大多数的冰冻切片机都有一种热吸收器可以使用。

3.组织块的填涂——基本的修复

填涂可以解决组织块自身的缺陷，下面我举几个具体的例子。

扁平包埋组织的填涂

包埋扁平的组织时，只有一层薄薄的包埋物贴附在底面，而且包埋物会轻微地收缩与组织块分离，如果想以最小的休整开始切片，那么收缩的空间必须填涂上包埋物，如果不填涂，切片时组织便会与包埋物分离，从而很难获得一张完整的片子。下面这个简单的技巧可以使你获得一个整齐的组织面。

挖凿的技术

当组织块中某些部分不需要或阻碍我们获得高质量的切片时，我们就可以将它挖除掉。最好的例子就是脂肪组织干扰切片，常见于切除的淋巴瘤用于检查是否癌转移。如果脂肪先于组织块中的其他部分接触刀片，你首先可以试着转动组织块，如果不行，就可以将它挖掉，然后用包埋物填充。

学会看片子

这里指的是片子滑过刀片时就要辨别出质量的好坏，如果到镜下才发现片子的缺陷那就无法挽救。

1.观察片子的厚薄

尽管冰冻切片机可以设置厚度，但人为辨别片子的厚度是否合适仍然很重要。片子太薄看起来象半透明的镜纸，片子太厚看起来混浊、柔性差，对我来说，5-6um的片子较合适，象一张薄的打印纸。

2.波浪线样的横皱

这是切片机零件松动的征象，可能需要修理，切片时刀片有移动或支撑刀片的机子有移动时，往往有这种规则的条纹出现。为了获得干净整齐的片子，所有固定刀片、刀架、支撑台、支撑栓子及切片机的旋钮、螺钉、轴承都必须上紧，并且不带有垃圾残骸，支撑台或刀片下面有一点包埋物都会影响切片的质量。

3.片子上的条纹

垂直于刀片的细条纹为刀片缺口所致，这往往是切到钙化组织、针头或缝线的结果。宽条纹，组织破碎或突然无法解释的切片困难往往意味着组织粘在刀片下面了，这在脂肪组织比较常见，这时刀片需要取下来清洗干净，注意清洗刀片时不要伤到自己。

脂肪组织的处理

脂肪组织无疑是冰冻切片者的绊脚石，道理很简单脂肪不会结冰，把温度降低让脂肪变硬可以切出较薄的片子，但是这个温度对同一组织中的其他成分来说显得太低而不合适切片，当脂肪破碎影响切片时这个问题就变得明显，下面是一些我的经验总结。

1.尽可能的削掉不需要的脂肪组织

当我准备切淋巴结时，我会先检查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓内的脂肪，结内的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜线附近的脂肪用刀切除，这样就不需要切开整个淋巴结被膜。有人会说，我把一些组织去掉后，可能导致漏判一些阳性的淋巴结，但我的经验是好的干净的片子比含有太多脂肪的差片子更容易获得阳性的结果。当你在休整组织或切片的过程中脂肪组织意外出现时，你也可以使用前面的挖凿技术。

2.调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片

切片时尽量避免脂肪先接触刀片，因为脂肪会脱离包埋物，在切片上留下一个洞，如果不能避免，也要在其周围加上包埋物，让包埋物先接触刀片。

3.保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度

切片机的台面和刀片必须保持干净，假如你弄碎了一张片子必须即时用一块干纱布清理干净，但要防止刀片割手，如果你发现切出来的片子有条纹或者堆积成束，可能是组织粘着在刀片的下方了，必须除掉刀片上的组织，并将刀片清理干净。

组织块越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪组织就变得坚硬难切，同时水性的组织会裂开，这就有必要在切片温度的最冷端和最温端取一个二者兼顾的中间值，以使脂肪和非脂肪组织都能切好。我一般将组织块冻在-24度，可以获得满意的结果，冷冻喷雾剂有用，但要注意先清掉切片机内的污秽。

4.灵活地转动摇柄而不犹豫

假如组织块是脂肪和结缔组织的混合物，那要好切于纯脂肪组织，有时候按照我前面所讲的技巧来做，片子会出乎意料的好。用运动的刷子快速粘住组织片并把它拖上台面，不要把刷子和组织片压上台面，以免粘在一起使切片完全中断。同样，好的刀片也很重要，如果你能用刷子敏捷地做出这套动作，那你肯定也能对脂肪组织切出理想的片子，脂肪在片子上会留下空的间隙，但它们之间的纤维条却保存完好。下面这块乳腺癌及其周围有数毫米覆盖着墨水的脂肪组织，假如你调整好组织块的方向使脂肪边缘垂直于刀片，肿瘤组织就切得好，脂肪切片的角度会有变动，也会留下空隙，但总有一条墨迹线指示着边缘的所在。很多时候我都用这种方法来区别肿瘤和脂肪组织。

冰冻切片的局限

1.时间的

确实在冰冻切片室经常受到快速出结果的压力，我的经验是欲速则不达，急躁和慌乱容易出错。我们最好的办法就是树立自信，良好的态度及教育外科医生，受到加快制片的催促时应当学会从各方面抵制压力，假如你是一位专业的受过良好训练的冰冻切片家，从切片到染出一张片子只需要几分钟，如果你对组织的处理很粗糙，这个过程可能要几分钟到十分钟，碰到比较大的复杂的组织需要多重染色则需要的时间会更多，对病理学家来说，阅片需要几秒到数十秒的时间，有时候需要搜寻一些细小的线索，翻阅书籍，或向同行咨询等，所需时间会更多。考虑到外科医生的处境，我们必须动作迅速，但是当所做的结论会更改手术的进程时，我们会显得格外谨慎。我们会要求提供患者的详细资料以便得到正确的答案，即使耽误几分钟，总比重做手术或提供错误的结论所付出的代价小很多，如果连续碰到几例患者，或复杂的病例，多个标本，那我们只有寻求帮助，当然，在手术不过急的依赖冰冻切片的结果时，这些事情尽量不做。不要粗糙地准备和阅读片子，这是最可能出错的地方，同时，也要识别超出你个人能力的处境，很多需要寻求外界咨询的场合，我象一根树桩一样站在那里阅片，几分钟都无法得出结论，就象看到一只从来没有在后院出现过的老虎一样。这个时候我会不顾一切的寻找就近的帮助，并且告诉我的外科医生要耐心的等待。

2.特殊染色的局限

这个问题讨论起来很难，我们只能面对，当今时代如果没有免疫过氧化物酶染色和基因突变的检测，仍然无法对淋巴瘤和肉瘤及其他类似的疾病进行分类，也许不久的将来能有快捷的方法用于冰冻切片，但是现在，确实是一个缺陷。

3.冰冻假象

这是水的特性，水在结冰时因氢键的交联而膨胀，正是这个原因，冰块才能浮在水面上。我相信组织在冰冻时候的变化与水结冰膨胀是密切相关的，在此，我会尽量解释冰冻片子和石蜡片子的差异。象处理其他病理假象一样，正确的识别这些冰冻假象有助于我们不至于误判。

冰晶的形成

含水量特别多的组织冷冻时会出现肥皂泡样的空隙，我认为当组织中的水分凝固时形成球形的冰晶，挤压纤维组织条而产生泡沫样的形状。下面的冰冻对照显示当组织片进一步处理时泡沫样的水分又重新分布于间质，而未曾冷冻的组织显示出间质的水肿。这些水分巨多的组织在切片时很难保证不裂开，应尽可能高切片的温度。

挤压假象

细胞实性的组织会受到冰泡膨胀的挤压，这在水肿组织非常明显，下面的肾细胞癌提供了一个很好的例子，中间的图片显示肾小管被透明的冰晶所挤压，右边的图片为来源于同一组织的非冷冻切片。

核染色质的改变

中间这张片子先前冷冻过，显示染色质特别明显，与左边冰冻后立刻固定的图片相比，核的密度更大，更深染，注意到冰冻片中胞浆含有较多的空泡，也是冷冻假象的一种。

冰冻切片的固定问题：

1. 取下来的标本怎么保存。我们实验室的做法是4％中性甲醛固定，然后转移至30％葡萄糖中，4度冰箱至组织块沉底。这样做的目的是使组织块充分脱水，避免冰冻切片时因组织中水分形成的冰晶在切片上造成孔洞，有孔洞的片子会很难看，甚至无法使用。

2. 切片时怎么包埋。上面有同学提到胶水，这个东西在不得已的情况下可以用来替代专用的包埋剂，我们实验室都用过。但是个人感觉还是用包埋剂的好，主要是包埋的时候不会产生气泡空泡，这在贴片的时候是很讨厌的事情。另外，胶水中的水分含量高对于组织包埋同样会产生不好的影响。

3. 冰冻切片用不用做抗原修复。一般来讲，做冰冻切片的目的就在与保持良好的抗原性，因此不用做抗原修复。但个人认为，要不要抗原修复，怎么修复，并没有一个绝对的答案。如果做的结果不好，就要从多个方面找原因，包括胰酶修复，蛋白酶修复等都可以尝试。

应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。

　　1．冰冻切片 是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。

冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。

（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二：

　　①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。

　　②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

　　影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类：

　　①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

　　②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节　，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。

冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。