阿霉素诱导胰腺癌细胞上皮-间质转化的研究

复旦大学上海医学院05级临床医学八年制华山班  刘恋

指导教师  复旦大学上海医学院病理学系  刘秀萍

【摘要】  目的  在临床上，化疗药物在除了治疗作用外，还可引起肿瘤恶性程度增高。最近，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在肿瘤进展过程中的作用引起了人们的注意。我们关心的是短时间应用阿霉素（Adriamycin, ADM）是否会引起肿瘤细胞发生EMT，明确Twist1是否为阿霉素诱导胰腺癌细胞EMT的关键转录因子。  方法  采用倒置相差显微镜和Western blotting法分别从细胞形态和标志性蛋白分子（E-cadherin、CK19、α－SMA和β-vimentin）的表达情况，观察加入阿霉素24、36、48和72 h后，胰腺癌细胞株（BxPC-3）发生是否发生EMT及其时间点。采用Western Blot检测阿霉素诱导BxPC-3发生EMT过程中Twist1的表达情况。  结果  治疗剂量阿霉素处理48小时后，BxPC-3细胞形态发生EMT的改变。上皮细胞标志性蛋白分子E-cadherin和CK19表达减少，间质细胞标志性蛋白分子α－SMA和β-vimentin表达增加。Twist1在阿霉素诱导BxPC-3发生EMT变化过程中表达不增高。  结论  治疗剂量阿霉素早期即能诱导BxPC-3发生EMT，Twist1不是关键转录因子。

【关键词】  EMT；胰腺癌； ADM

Adriamycin-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Pancreatic Cancer Cells

【Abstract】 

Purpose: Besides its therapeutic effects, chemotherapeutic agents also enhance the malignancy of treated cancers in clinical situations. Recently, epithelial-mesenchymal transition (EMT) has attracted attention in studies of tumor progression. We aimed to test whether transient Adriamycin treatment induces EMT in pancreatic cancer cells, and elucidate the role of Twist1, the master regulator of EMT, in this process.

Experimental Design: In BxPC-3 cells, EMT after Adriamycin treatment was examined in vitro by inverted phase contrast microscope and Western blotting at 24, 36, 48, 72hours, to examine morphologic and molecular changes respectively. The Adriamycin-induced Twist1 expression was examined by Western blotting.

Results: We showed in vitro that Adriamycin induced EMT at 48h in morphology and 36h in molecular. The expression of Twist1 did not increase in the process of ADM induced EMT.

Conclusions:  ADM induces EMT of pancreatic cancer cells very early. Twist1 is not the key regulator of ADM induced EMT of pancreatic cancer cells.

【Key Words】  EMT; Pancreatic cancer; ADM

   上皮－间质转化（Epithelial-Mesenchymal　Transition，EMT)，胚胎发育中形态生发的一个关键过程，是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。它以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征,具体包括: 细胞黏附分子( E－钙黏蛋白)表达减少；角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，从而引起细胞形态的改变。有多种转录因子（如Slug, Sip1, AP-1,NF-κB, Twist等）EMT的发生涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，已证明与EMT的发生密切有关，其中Twist1为多种癌细胞株EMT的主要转录因子。EMT在肿瘤侵袭处转移中重要作用的研究,已成为肿瘤研究中的一个热点。大量的数据证实，肿瘤细胞经过这种细胞表型的转化（EMT），除细胞特性转变外，更重要的是细胞获得高的侵袭性，使肿瘤细胞转化成恶性程度更高的细胞表型[1]。

    阿霉素诱导乳腺癌细胞EMT已经得到证实，EMT的主要转录因子是Twist1，但在胰腺癌细胞中是否相同我们不得而知。本实验探究治疗剂量阿霉素诱导胰腺癌细胞株BxPC-3是否诱导EMT及其时间点，以及Twist1是否为EMT的主要转录因子[2]。

材料与方法

细胞培养    人胰腺癌细胞株BxPC-3购自American Type Culture Collection，用含10%胎牛血清的RPMI 10培养。

细胞形态学变化的观察 采用倒置相差显微镜（Olympus）观察细胞形态的变化。采用数码相机（Nikon）照摄照片。

Western blotting  采用RIPA裂解缓冲液（Santa Cruz Biotechnology）提取总蛋白，每条道50µg蛋白提取物进行电泳。电泳后转二氟化树脂膜。加入抗E-cadherin(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), CK19 (Santa Cruz), α-smooth muscle actin (SMA; Sigma), vimentin (Chemicon International), Twist1 (Santa Cruz Biotechnology)抗体。加入Alexa Fluor 700/800 nm结合的二抗(Invitrogen)孵育后，采用Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor BioSciences)进行分析。

结果

阿霉素诱导EMT    在细胞培养液中加入阿霉素后，分别在12、24、36、48和72小时后在显微镜下观察细胞的形态，发现在48小时发生EMT的形态改变：连接紧密的细胞变得扁平，且失去了大部分细胞连接（见图1）。这种形态变化与E-cadherin、CK19表达减少，α-SMA、vimentin表达减少有关。对作用36小时的细胞用Western blotting进行检测，发现上皮细胞标志性蛋白分子E-cadherin和CK19表达减少，间质细胞标志性蛋白分子vimenti和α-SMA表达增加，表示细胞失去上皮表型，开始间质化（见图2）。且分子表达的改变早于形态学的改变。总之，阿霉素能诱导上皮肿瘤细胞发生EMT。

Twist1不是阿霉素诱导BxPC-3细胞发生EMT的关键转录因子   Twist1在阿霉素诱导EMT过程中表达未见增加，与阿霉素作用剂量和时间也不相关。

—                                 ADM

图1. 采用相差显微镜从细胞形态观察加入治疗剂量阿霉素（25μg/ml）48 h后，胰腺癌细胞株(BxPC-3)细胞形态发生EMT改变（放大倍数：100倍； bar, 10 Am)。

图2. Western blotting法检测E-cadherin, CK19, vimentin, and α-SMA的表达情况。上皮细胞标志性蛋白E-cadherin和CK19表达减少，间质细胞标志性蛋白vimentin和α-SMA表达增加。

讨论

    化疗是抑制癌细胞生长的系统性治疗手段。尽管化疗药物能够有效清除肿瘤细胞，也有报道称化疗药物引起肿瘤细胞恶性程度增加。在临床工作中，化疗可引起肿瘤细胞对化疗药物耐药、转移的风险增加，从而导致治疗失败（如肿瘤复发）。肿瘤细胞对化疗药物反应不同，原因尚不清楚。

    在这个研究中，我们发现胰腺癌细胞经过阿霉素处理，发生EMT，我们观察到胰腺癌细胞发生EMT的形态变化，通过EMT标志性蛋白分子进一步证明EMT的发生。Kajiyama等人在对紫杉醇慢性耐药的上皮性卵巢癌细胞中发现有EMT的形态、细胞活力和分子的改变，提示我们EMT与肿瘤细胞对化疗药物的耐药有关[3]。加入阿霉素36小时之后，BxPC-3细胞即发生EMT，说明阿霉素诱导胰腺癌细胞发生EMT是一个早期事件，如何早期阻止EMT的发生，对防止形成耐药性、降低转移的风险有重要意义。

    Twist1是调节EMT的主要转录因子。李清权等人用阿霉素诱导乳腺癌细胞株MCF7发生EMT，Twist1为关键转录因子，用siRNA抑制Twist1的表达，大大降低了EMT的发生，在体内试验和动物试验中均提高了阿霉素的疗效[2]。而在胰腺癌细胞株BxPC-3中，Twist1表达未见增加，说明不同的肿瘤细胞EMT的转录因子是不同的，需进一步研究胰腺癌细胞EMT的关键转录因子。

References:

[1].    Kalluri, R. and R.A. Weinberg, The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest, 2009. 119(6): p. 1420-8.

[2].    Li, Q.Q., et al. , Twist1-mediated adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition relates to multidrug resistance and invasive potential in breast cancer cells. Clin Cancer Res, 2009. 15(8): p. 2657-65.

[3].    Kajiyama, H., et al. , Chemoresistance to paclitaxel induces epithelial-mesenchymal transition and enhances metastatic potential for epithelial ovarian carcinoma cells. Int J Oncol, 2007. 31(2): p. 277-83.

致谢：感谢莙政基金提供的资金和病理学系刘秀萍老师提供的悉心指导。