发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计

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发酵食品工艺学

作业题目：发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计

纳豆芽孢杆菌的选育方法和实验设计

纳豆是日本常见的传统发酵食品，由黄豆通过纳豆菌发酵制成豆制品，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素K2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。

纳豆芽孢杆菌是从纳豆中发现并分离出来的，属于细菌科芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种，它具有强力溶纤作用。纳豆芽孢杆菌耐酸、耐碱、乃100℃高温并耐挤压，在制粒过程中及酸性的胃环境中均能保持稳定性，它的代谢产物具有降血压、抗肿瘤、抗氧化性、溶血栓等作用；纳豆芽孢杆菌能使肠道酸化而有利于维生素、铁、钙等的吸收，能明显提高蛋白酶脂肪酶和淀粉酶的活性，还能够抽筋双歧杆菌乳酸菌和梭菌等厌氧菌的生长，有抑制肠道中肠杆菌和肠球菌等好氧菌的生长，促进宿主倡导菌群正常生长，保持微生态平衡。

选育方法

1.材料

1.1菌种

纳豆芽孢杆菌

1.2培养基

种子培养基：1.5%葡萄糖，2%大豆蛋白胨， 0.2%，0.1 %，0.02%，0.05%，pH=7.0。

活化培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，1% NaCl，0.05%，pH= 7.0。 

发酵培养基：2%葡萄糖，2%大豆蛋白胨，0.2%  ，0.1%，0.02%，0.05%，pH =7.0。

2.方法

2.1菌种活化

从保藏斜面中取1环菌体于10 mL种子培养基中，35 ℃，150 r·min-1活化培养18 h左右，然后按1%接种量接种于100 mL活化培养基中，35 ℃，150培养24 h左右。

2.2菌悬液制备

把对数生长期的活化菌液300×g冷冻离心8min，去上清液，收集菌体，用灭菌的生理盐水悬浮菌体，得到菌悬液。把菌悬液倒入已灭菌的三角瓶中，加入灭菌玻璃珠，振荡至细胞分散。用显微镜进行计数，分散程度要求达到90%～95%左右，用无菌生理盐水进行稀释，使菌悬液浓度约个。 

2.3菌种诱变

用不同剂量的分别进行注入诱变，注入能量为15 keV，靶室真空度为l0～13 Pa。将平皿置于水冷靶台上，用5s脉冲式注入，间隔55 s剂量率，按照试验设定的不同剂量进行诱变。

2.4菌种复选

把初筛的菌株接入种子培养基中，36 ℃、200培养16 h后，按4%的接种量接种于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，36 ℃，200培养96 h，然后各取10 mL发酵液于1 300×g离心10 min，取上清。分别取上清液和尿激酶溶液(100)各7，点在同一琼脂-纤维蛋白平板的不同位置上，加盖，置于37 ℃恒温培养箱中，每隔2 h观察纤维蛋白溶解情况。17 h后进行照相、测量溶解圈的垂直直径，算出溶解圈垂直直径的乘积。然后精确测定乘积较大的复筛菌落发酵上清液的纤溶酶活性，与出发菌株相比，相对酶活小于95%的定义为负突变菌株；相对酶活大于 105%的定义为正突变菌株，而相对酶活在95%~105%之间为非变异株或实验误差。

2.5遗传稳定性实验

复筛得到的突变株接种于琼脂营养斜面作传代实验，共传10代。每传代一次在相同培养条件下进行摇瓶发酵，测量发酵上清液的纤溶活性。

3.菌种实验室平面布图

4.房间用途及设计思路

1.办公室

供工作人员办公休息。

2.培养基制作室

培养基室是制作、配制微生物培养所需的培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为操作台与药品柜。操作台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用；还要放天平，以称取药品用；操作台材料要耐高热、耐酸碱；药品柜分门别类存放一些一般药品及试剂。

3.菌种培养室

培养基室是制作、配制微生物培养所需的培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为操作台与药品柜。操作台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用；还要放天平，以称取药品用；操作台材料要耐高热、耐酸碱；药品柜分门别类存放一些一般药品及试剂。

4.实验室

理化分析室是物理化学分析的主要操作室。实验台与细菌操作室要求相同，设置通风橱以满足加热、消化、干燥、烧灼和化学处理等工作需要。

发酵工厂菌种实验室的设计对防止污染杂菌相当重视，因此在结构和布局上精心设计，合理安排。在仪器设备的选择和布置上本着既要满足工作要求，又要便于操作的原则。从先进性、适用性和经济性等方面统筹考虑，进而构建了菌种实验室的平面图

5.洗涤室

洗涤室用以消毒洗涤待用与已用之玻璃器皿，培养基及污物。洗涤消毒室应设有：1-2个洗涤池，洗涤池上下水网要畅通；器皿柜或实验台，以放置洗涤好的器皿；高压灭菌锅，其所用电源应满足用电负荷；室内装有通风装置（通风柜）或换气扇。

6.无菌室

无菌室通过空气的净化和空间的消毒为微生物实验提供一个相对无菌的工作环境，与外界用两道缓存间隔开。无菌室与缓冲间均装有紫外灯，要求每3平米安装30w紫外灯一盏；无菌室是处理样品和接种培养的主要工作间，应与细菌检验操作室紧密相连，无菌室与操作台之间设有双层窗构成小通道。

5.主要仪器设备型号及厂家

1.DHP-420电热恒温培养箱

能  力：箱体外壳采用优质冷轧钢板喷塑精心制作而成，以硅棉作保温材料，箱门中间有玻璃观察窗，以供观察工作室内情况，智能型温控仪控温更精确，本系列产品具有：美观、耐腐蚀、控温稳定、节能实用等特点。

用  途：该系列产品用于干燥、温渍学药品或生物制品、细菌培养等。

参考价：1760

2.YuanMore元茂电热恒温鼓风干燥箱DHG-9109A

能  力：微电脑智慧控温仪，具有设定，测定温度双数字显、定时、功率抑制和自整定功能，控温精确可靠。热风循环系统由低噪声风机和风道组成，工作室内温度均匀。

用  途：供工矿企业、化验室外、科研单位等作干燥、烘焙、熔腊、灭菌之用。

参考价：10200

3.立式压力蒸汽灭菌锅LS-75LJ

能  力：外排气 指示灯 螺丝旋钮型 定时 温控 断水自控

用  途：用于实验所用器材的灭菌。

参考价：7600

4.HCY-123A组合式恒温振荡培养箱

能  力：可多温度、多速度控制；极大提高实验室空间利用率。

用  途：菌种培养时要求温度湿度。（广泛应用于微生物、病毒、动植物、药物细胞组织对温度、振荡频率有不同要求的培养）。

参考价：53800

6.对本设计的功能和适用性进行评价

产纤溶酶的纳豆芽孢杆菌最初日本豆豉中分离得到，由于其产生豆豉中的纤溶酶不仅活性高，而且无毒副作用，不会引起内出血，在体内的半衰期长，具有非常优异的药用价值，因此纳豆芽孢杆菌成为产生纤溶酶药物的首选菌株，利用该菌株生产产纤溶酶的研究取得长足进展。