细胞凋亡检测的研究进展

细胞凋亡检测的研究进展

朱启星　沈　彤

2002-08-30收稿(特约稿)

作者单位:安徽医科大学公共卫生学院,合肥　230032作者简介:朱启星,男,44岁,教授,硕士生导师,院长

主题词　脱噬作用中图分类号　R329125

文献标识码A 文章编号1000-1492(2002)06-0411-04

　　细胞凋亡(Apoptosis ),又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death ,PCD ),是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的、基因控制的、一系列酶参与的过程。它被认为是维持机体内环境稳定,清除衰老和细胞的重要机制〔1〕。研究证实细胞凋亡紊乱与许多疾病的发生和发展有关,正是由于其在病理学研究中的重要作用,引起了人们对其机制和组分的广泛而深入研究,近年来已成为目前生命科学界研究热点之一,也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。细胞凋亡的启动和执行过程中有许多重要事件,可通过一定的方法和技术进行检测。细胞凋亡的检测不仅对实验理论研究有重要意义,而且可用于指导临床疾病的诊断和防治。随着这方面研究的持续升温,涌现出了大量新的技术和方法,其中不少已经有商品化产品出现,大大加速了研究的进程。现就近年来针对细胞凋亡不同阶段有关检测方法的研究进展作一综述如下。1　早期检测

1.1　反映细胞膜改变的检测

11111　拒染法判断膜完整性　细胞发生凋亡时,细

胞膜的通透性增加,程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,采用流式细胞仪测量荧光强度可区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞

〔2〕

。通常用Hoechs 2PI 双染色

法,正常细胞对染料有拒染性,荧光着色浅,凋亡细胞主要摄取Hoechs 2PI 染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI )而呈红色荧光。

11112　膜对称性改变———细胞外膜上磷脂酰丝氨

酸(Phosphatidylserine ,PS )的检测　细胞受到凋

亡诱导后不久,PS 从细胞膜内侧转移到外侧,成为免疫系统的识别标志。将能与PS 高亲和力特异性结合的钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin 2V 进行荧光素(FITC 、PE 、EGFP )或Biotin 标记,作为荧光探针,利用流式细胞仪、荧光显微镜或酶联显色反应可检测细胞凋亡的发生〔3〕。这种凋亡早期的活细胞检测对悬浮细胞和贴壁细胞都适用,与DNA 染料或别的晚期检测方法结合可标记凋亡的发展阶段,如Annexin V 联合PI 法可将凋亡早晚期细胞以及死细胞区分开来;由于PS 外露发生早于DNA 断裂,以及不需固定细胞,故此法定量检测早期细胞凋亡较TUN EL 法更灵敏,且可避免PI 染色法因固定造成的细胞碎片过多和TUN EL 法固定造成的DNA 片段丢失,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。另外,磁珠包被的Annexin V ,可用于磁分选方法筛选凋亡细胞。1.2　细胞内氧化还原状态改变的检测　凋亡早期出现细胞内氧化还原状态改变,通常用体外检测凋亡细胞胞质中谷胱甘肽(GSH )的减少来反映这一变化,其显示了细胞凋亡研究中相对较新的趋势。细胞内GSH 清除有毒氧化物非常活跃时,胞液由还原环境转为氧化环境,可引发半胱天冬氨酸蛋白酶

(caspase )级联反应〔4〕

。GSH 可用商品化试剂盒通过荧光染料(如Monochorobimane ,MCB )来检测。由于GSH 与氧化还原作用及线粒体功能密切相关,此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外,

还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究〔5〕

。但有些细胞如:HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH 水平的变化,不能用此法检测。1.3　细胞色素C(Cyt C)的定位检测　凋亡信号刺激使Cyt C 从线粒体膜间隙释放至细胞液,结合凋亡蛋白激化因子Apaf 21后启动caspase 级联反应。凋亡发生时线粒体内膜上膜蛋白Cyt C 氧化酶亚单位Ⅳ(COX4)保留在线粒体内,可作为线粒体富集部分的一个非常有用的标志。ApoAlert TMCell Frac 2tionation K it 不用超离心,可从凋亡和非凋亡细胞中

1.5　相关基因mRNA水平的检测　在细胞凋亡时有些基因表达异常,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道,Fas 蛋白结合受体后形成死亡介导信号复合体(DISC),能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞等靶细胞调亡〔8〕。Bcl22和Bcl2X L作为抗凋亡的调节物,它们的表达水平比例决定细胞是凋亡还是存活〔9〕。现多采用Northern杂交和R T2PCR对它们进行检测,随着近年来荧光定量PCR技术的发展,用定量PCR 来检测基因表达水平较前者更快更准确。

1.6　凋亡相关酶类活性测定

1.6.1　Caspases家族活性测定　凋亡程序的启动及执行过程中,称为凋亡效应器的Caspases蛋白酶家族起了非常重要的作用,直接参与凋亡早期启动,凋亡信号的传递以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物,产生细胞皱缩,膜出泡,DNA断裂等凋亡特征现象。它们是ICE相关蛋白酶家族成员,本质是一些半胱氨酸蛋白酶,正常状态下,均以无活性的原酶形式存在,可被凋亡信号刺激在其特异性剪切位点天冬氨酸(Asp)残基处剪切后激活,同时释放N2端结构域,一些上游的Caspase就能次序地激活其它下游的Caspase,形成Caspase级联反应,将凋亡信号一级级传至凋亡底物〔10〕。目前Caspase的检测主要有两类方法。

1161111　抗体法:活性Caspase抗体,只识别被剪切后的活性Caspase亚基,不识别全长的Caspase和非活性亚基,解决了一般Caspase抗体针对全长Caspase中某些抗原表位,与全长Caspase和Caspase 某个亚基(活性或非活性)都起反应而无法鉴别Caspase活性的问题,无论做Western Blot,EL ISA,免疫细胞化学,免疫组织化学(有的还可做石蜡切片)都能真正揭示凋亡机制〔11〕。同时,还有可用作检测对照的普通Caspase抗体。

1161112　人工底物和抑制剂法:在没有活性抗体之前,这是检测Caspase活性的主要方法。主要根据Caspase与底物作用的偏爱序列设计。研究报道, Caspase底物与其结合部位有一些特定的氨基酸, Asp残基羧基侧链又被Caspase特定的四肽序列包围,且这四肽序列已足够识别底物。底物与Caspase 结合的特异性肽序列加上一些检测标记(荧光物或发色团)和其他辅助基团即成为人工底物和抑制剂的基本结构〔12〕。此法操作简便,若采用荧光标记,检测也很灵敏,但一般只可用于细胞的Cas pase活性检测,不能做组织样本。也可通过Western Blot、荧光分光光度计分析、流式细胞术等进行分析。

1.6.2　凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析　TFAR19(PDCD5)是定位于细胞核,具有促进多种肿瘤细胞凋亡和抑制增生作用的调亡相关蛋白。用荧光素(FITC)标记的TFAR19单克隆抗体为探针,对凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现,早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象,伴随着细胞核形态学的变化,持续较长时间,在凋亡小体中仍然可见。凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于PS外翻和核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一〔13〕。进一步的研究证明,凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义,不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位〔14〕。这为研究凋亡早期发生的事件,提供了一种新的技术和指标。可用EL ISA法和Western Blot分析。

2　晚期检测

2.1　形态学检测　根据凋亡细胞固有形态特征,人们设计了多种不同的细胞凋亡形态学检测方法,这是研究凋亡的最基本方法。常用的有:倒置显微镜观察、普通显微镜观察、荧光显微镜观察、共聚焦激光扫描显微镜观察、透射电子显微镜观察(观察细胞形态最好的方法)。凋亡小体可使细胞光散射性质发生变化,可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察凋亡细胞;此法可与免疫荧光技术结合,测定凋亡细胞表型〔15〕;但不是凋亡细胞十分特异的标志,至少用两种以上方法才能准确鉴定凋亡细胞。

2.2　D NA降解的检测　细胞凋亡晚期,Caspase作用于其底物核酸内切酶,在核小体连接处裂解染色质DNA,形成180～200bp或其整数倍的寡聚核酸,在凝胶电泳上表现为梯状条带(DNA ladder)。

2.2.1　大分子染色体DNA片段的测定　细胞凋亡早期,染色体断裂为50～300kbp长的DNA大片段,不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。采用脉冲电泳即在凝胶上外加正交的交变脉冲电场技术可解决这一问题〔16〕。

2.2.2　DNA Ladder测定　细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder,表现为排列成梯状的条带。正常细胞DNA 电泳只出现一条距加样孔很近的大分子条带;坏死细胞DNA电泳呈弥散的片状图谱,没有明显条带〔17〕。

2.2.3　DNA片段原位末端检测技术　如果细胞量很少,可在分离提纯DNA后,保持细胞(或组织)结构不变情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(DU TP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应与凋亡细胞裂解的3′2OH端结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。通常有两种①原位缺口转移(ISN T)技术,是利用DNA多聚酶Ⅰ将标记的核苷酸接到断裂的3′2OH端。②原位缺口末端原位标记(ISEL)技术,即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUN EL),是利用TdT将标记的DU TP接到3′2OH端〔18〕。实际上这是分子生物学与形态学相结合的方法,可直接用荧光标记,地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色,可用于石蜡包埋或冰冻的组织切片、培养的细胞和分离的细胞的形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用,对早期凋亡的检出更为适用,但坏死细胞亦可呈阳性反应。直接标记步骤少,操作简便;而间接标记有信号放大的作用,检测灵敏度高。

2.2.4　LM2PCR(连接介导的PCR)检测　当凋亡细胞比例较小及检测样品量很少(如活体组织切片)时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA变化。通过LM2PCR连上特异性接头,专一性地扩增核小体的梯度片段,可灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段〔19〕。此外,LM2PCR检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

2.2.5　端粒酶(Telemerase)检测　端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的,每一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。TRAP2eze端粒酶检测试剂盒提供特定的寡核苷酸底物和分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同个数的6碱基(GGTTA G)端粒重复序列,通过PCR反应,产物电泳检测就可观察到相差6个碱基的DNA Ladder现象〔20〕。还有用酶联免疫法(EL ISA)检测的试剂盒。这是相对来说推出较早,用得较多的一种方法。

2.2.6　单细胞凝胶电泳(SCGE)　直接观察DNA 断片出现的彗星试验。以地塞米松(DEX)诱导并经G iemsa染色法和琼脂糖凝胶电泳确定的凋亡细胞在彗星试验中呈现特征性的彗星形态,与DNA断裂剂诱发的彗星细胞易于区别;同时彗星试验中的凋亡细胞与正常细胞也极易区别,便于记录凋亡细胞在某一细胞群体中的出现率。其次,彗星试验利用电场的作用使DNA断片迁移出去,形成“彗星”尾,正常细胞则不拖尾。此法是一种灵敏、准确、简便、既可定性又可定量检测细胞凋亡的方法〔21〕。2.2.7　DNA含量的流式细胞仪(FCM)分析　以特异性荧光染料染色后,细胞内成分与荧光强度成正比,凋亡时表现为荧光强度下降,故可用FCM进行定量检测,主要有单参数(PI单染色法)、双参数(Heochst33342/PI双染色法)及多参数分析等方法。此法检测的细胞数量大,因此反映群体细胞的凋亡状态比较准确,可用于相关分析;结合被测细胞DNA含量分析,可确定凋亡细胞所处的细胞周期〔22〕。但该法也受标本制作复杂,非原位检测,不易与变性细胞鉴别等因素的。

2.2.8　染色体DNA断裂及细胞形态同时分析　凋亡细胞内已降解的低相对分子质量DNA可漏出细胞外而丢失,用DNA荧光染料进行染色时,其DNA含量低于G1期细胞,出现亚二倍体峰。在洗涤细胞时,加入p H718磷酸盐/柠檬酸缓冲液可有效地控制抽提DNA的多少,被抽提到缓冲液中的DNA可通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA梯状带,剩余的细胞可继续进行PI等DNA荧光染料染色〔23〕。本法使用同一份样品,既进行DNA ladder测定,又用FCM测定DNA含量,同时得到生物化学和形态学实验数据。

2.2.9　酶联免疫(EL ISA)分析法　采用抗体夹心法(Sandwich,EL ISA)进行测定,首先用抗组蛋白抗体包被酶标测定板,接着用封闭试剂封闭,然后加人含核小体和寡聚核小体的凋亡细胞裂解物,核小体即可与抗组蛋白抗体结合,最后,加入过氧化物酶(POD)标记的抗DNA抗体,可与已固定在酶标板上的核小体或寡聚核小体中DNA结合,在POD底物存在下,产生颜色反应,通过酶标测定分析,即可定量测定凋亡细胞〔24〕。抗组蛋白抗体可与人、小鼠、大鼠、仓鼠、牛、猪和果蝇的组蛋白结合,用POD 标记的抗DNA可与单链和双链的DNA结合。此种设计的EL ISA方法,可测多种不同的培养细胞株或从动物组织中分离的凋亡细胞。

　　总之,随着分子生物学及细胞生物学技术的迅猛发展和对细胞凋亡研究的不断深入,细胞凋亡检测方法和技术也不断涌现,特别是对凋亡早期相关事件的检测越来越引起人们的兴趣。这些方法日趋成熟、完善和全面,而且更加准确、灵敏和简便,更有助于细胞凋亡的研究取得突破性进展。

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