丛枝菌根侵染率研究

一、检测孢子含量的方法

A湿筛倾注法

1. 称取一定重量的土壤样品（最好是取自15cm 表层植物根系附近的土壤），放在容器内用水浸泡20-30min，使土壤松散。如果土壤粘性很大，也可加入各种土壤分散剂。

2. 选用一套洁净的具有孔径为0.5-0.034mm的土壤筛，依次重叠起来。最底层用一物体垫着（如培养皿、木块等物），使筛面稍微倾斜。

3. 用玻璃棒搅动浸泡的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，即将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层孔径最大的土壤筛上。倾倒时，最好集中倒在筛面的一个点上，不要使整个筛面都沾有土壤溶液。

4. 用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物，以免在上层粗筛面的剩留物中夹藏有VA菌根真菌孢子。

5. 用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面，再将滤液通过细筛并用水冲洗。在冲下来的筛出物中，除有许多细的沙砾和杂质外，就含有VA菌根真菌的不同直径的孢子。

6. 将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察。

B 蔗糖离心法

1.  称取10 g菌剂，置入大烧杯中加500 ml水，搅拌，静置10 s。

2.  先后过80目分样筛、400目分样筛，将400目筛子上的残余物用药匙转入50ml 离心管中，后用清水冲洗筛子，将残余物全部转入离心管中，配平，3000转/min 离心10 min。（注分样筛最好直径为12 cm左右，便于下面放置烧杯过筛）

3.  去掉上清液，在离心管中加入预先配制好的质量分数为50%的蔗糖溶液，玻璃棒搅匀，配平，3000转/min 离心10 min（注意离心前离心管壁上不能有残余物）。

4.  将400目筛子呈一斜面放置，离心后的蔗糖溶液过筛子的下侧，用水将筛子上的残留物轻轻洗入划线培养皿中。（注意水不能加太多以防影响检测，培养皿划线便于统计）。

5.  解剖镜镜检统计培养皿中的孢子数目，计算出菌剂中的孢子含量。

 注：溶于蔗糖溶液中的孢子仍可进行接种。

A. Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-244

B .刘润进，李晓林．2000．丛枝菌根及其应用．北京：科学出版社：190-194

二、检测菌根侵染率的方法（曲利苯蓝染色改良法）

Phillips J M，Hayman D S，1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158~161

挑根—碱液软化—酸化—染色—脱色—制片、镜检

1.将洗净的粗细合适的根系剪成 1 cm左右的根段至于三角瓶中。

2.加入10% KOH在90℃的水浴锅中染色45~60 min(去除细胞质，便于染色。一般幼根需要时间较短约0.5 h，老根需要时间长约1 h，以根系相对透明为标准)。

3.弃去碱液，用清水洗3~5次（晾至室温后再冲洗），加入2%盐酸室温下酸化5 min。

4.加入0.05%曲利苯蓝于90℃水浴锅中染色30min。

5.去除曲利苯蓝后，弃去溶液后用自来水冲洗，加入乳酸甘油溶液(1:1:1 )室温下脱色24h，（晾至室温后再冲洗，也可直接脱色）。

6.用镊子夹取15条排列在载玻片上，每个样30条2个片，显微镜镜检（10×10）。

说明：常规制片用水即可，或封固剂（聚乙烯醇1.66g，甘油1 ml，乳酸20ml ，蒸馏水10ml）制片片子可以保存较长时间，但容易产生气泡，经脱色后的植物根系可以在甘油中保存数月。

三、统计方法

Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al

 丛枝菌根真菌侵染性的评估方法(Trourelot等，1986)

∙Trouvelot A, Kough JL & Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In : Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221. 

∙

1.将15个根段固定在1张载玻片上，30个染色后的植物须根根段制2个片子。

2.在显微镜下观察这些根段，按照图1的分类方法确定分级，这种分级包括对每个根段菌根侵染率水平和丛枝丰度的快速评估。

3.将观测值代入计算机软件“Mycocale”中即可按照以下相关公式计算出相关的菌根侵染度参数：%F,%M,%m, %a和%A (Trouvelot et al 1986)

oFrequency of mycorrhiza in the root system

根系中的菌根侵染率(%F)=有菌根根段数/总根段数*100

oF% = ( nb of fragments myco/total nb)*100 

oIntensity of the mycorrhizal colonisation in the root system

根系中的菌根侵染强度(%M)=( 95*侵染率90%以上根段数+70*侵染率50%至90%的根段数+30*侵染率10%至50%的根段数+ 5*侵染率10%以下1%以上根段数+ 侵染率1%以下根段数)/总根段数*100

oM% = (95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/(nb total)

where n5 = number of fragments rated 5; n4 = number of fragments 4 etc. 

oIntensity of the mycorrhizal colonisation in the root fragments

相对菌根强度即根段中的菌根侵染强度(%m)=M*总根段数)/有菌根根段数

om% = M*(nb total)/(nb myco) 

oArbuscule abundance in mycorrhizal parts of root fragments

a% = (100mA3+50mA2+10mA1)/100

(相对丛枝率)菌根根段丛枝率(%a)=( 100*mA3+50mA2 + 10mA1)/100,其中mA3,mA2,mA1分别是A3，A2，A1所对应的菌根侵染强度

owhere mA3, mA2, mA1 are the % of m, rated A3, A2, A1, respectively, with mA3=((95n5A3+70n4A3+30n3A3+5n2A3+n1A3)/nb myco)*100/m and the same for A2 and A1. 

oArbuscule abundance in the root system

(绝对丛枝率)根系丛枝率(A%) = a*(M/100)

Figure 1

注：现在找不到“Mycocale”这个软件了，我一般都是显微镜检测后自己计算结果。统计菌根侵染率的方法有很多，有网格交叉法、频率标准法等，可以搜一下相关文献。另附《丛枝菌根及其应用》（刘润进，李晓林主编，2000，科学出版社）的190-199页。

四、球囊霉素相关土壤蛋白

试剂配制：

1.柠檬酸钠浸提剂的配制：分别称取14.705g、5.882g柠檬酸钠溶于500ml去离子水中，定容到1L，即50mmol L-1pH调至8.0、20mmol L-1pH调至7.0柠檬酸钠

2.牛血清蛋白标准溶液：称取100mg0.001牛血清蛋白溶于蒸馏水中，定容到100ml即为1g L-1的牛血清蛋白标准溶液，稀释10倍（现配现用）

3.考马斯亮蓝染色剂的配制：称取考马斯亮蓝G250 100mg加95%乙醇50ml，加85%（m/V）磷酸100ml，去离子水稀释至1000ml，保存于棕色瓶中

试剂

4.易提取球囊霉素相关土壤蛋白（EEG）：分别称取土样 1.00 g 于带刻度离心管中,对应加入 8 mL 柠檬酸钠浸提剂(20 mmol.L-1、pH 值 7.0),加盖,摇匀,在 103 kPa、121℃下提取 30 min,10 000×g 下离心 6 min,收集上清液，每个处理重复 4 次，提取1次，用蓝色记号笔。

5.总球囊霉素相关土壤蛋白（TG）：分别秤取土样 1.00g 于带刻度离心管中,对应加入 8 mL 柠檬酸钠浸提剂(50 mmol.L-1、pH 值 8.0),加盖,摇匀,在 103 kPa、121℃下提取 60 min,，再重复提取 5 次,每次重复提取时,保证提取液体积固定且摇匀土样,使土样与浸提剂充分接触;每提取一次之后迅速在10 000×g 下离心 6 min,将上浮物从土壤中分离出去,收集上清液,每个处理重复 4次。上清液储藏在 4℃下直至第 2 天分析。

球囊霉素相关蛋白的测定:分别吸取 0.5 mL 的上清液,加入 5 mL 考马斯亮蓝G-250 染色剂(使用之前过滤),加盖,震荡,显色 10 min,于 595 nm 波长下比色。用牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)作标准液,考马斯亮蓝法显色,绘制标准曲线，最后含量单位表示μg/g

菌根参考书

   期刊：Mycorrhiza

1.J.R.Norris,D.J.Read,A.K.VARMA.1992.Techniques for mycorrhizal research

2.国内有《菌根学》 刘润进、陈应龙主编

 《丛枝菌根及其应用》 刘润进、李晓林主编

 《丛枝菌根生理生态学》 宋福强主编

 《AM培养新技术及其对土地复垦生态效应》  毕银丽主编

 《园艺植物丛枝菌根研究与应用》 吴强盛主编