溶藻放线菌改性制剂对铜绿微囊藻的控藻能力研究

V o l .4,N o.4

2010年4月

Ch i n ese Jour nal of Env iron m enta lEng ineeri n g

A pr.2010

溶藻放线菌改性制剂对铜绿微囊藻的

控藻能力研究

唐 晨1

赵以军1

肖慈琼1

程 凯

1*

高 峰

2,3

(1 华中师范大学生命科学学院城市水环境生态学湖北省重点实验室,武汉430079;

2 武汉大学水利水电学院,武汉430072;

3 广州市番禺区水利局,广州511400)

摘 要 采用喷雾干燥法制备了一种溶藻放线菌粉剂,此粉剂按1 10000的质量比投加4d 后对铜绿微囊藻的溶藻效率可达90%,该粉剂经过壳聚糖改性处理后,在1 20000的质量投加比下,0 5h 即可絮凝去除90%的藻细胞,4d 后的溶藻效率仍可达80%。由于既能快速絮凝除藻,又能长效溶藻,使得改性溶藻放线菌粉剂具有更为广阔的应用前景。

关键词 铜绿微囊藻 溶藻 放线菌 壳聚糖

中图分类号 X522 文献标识码 A 文章编号 1673-9108(2010)04-0756-05

Controlli ng effect over M icrocystis aeruginosa by chitosan -modified -algae -l ysi ng -acti no m ycetes -powder

Tang Chen 1

Zhao Y ij u n 1

X i a o C i q i o ng 1

Cheng K ai 1

G ao Feng

2,3

(1 H ubeiK ey Laborat ory ofU rban W ater Environm en t a lE col ogy ,College ofL ife Sci en ce ,

Cen tral Ch i na N or m alUn ivers i ty ,W uhan 430079,C h i na ;2 Schoo l ofW ater R esource and Hydropo w er ,W uhan Un i versity ,W uh an 430072,Ch i na ;

3 Guangz hou Panyu Reg i on W at er Res ource Bu reau ,Gu angzhou 511400,C hina)

Abst ract A sort o f algae -l y si n g -actino m ycetes -po wder w as pr oduced by spray dry i n g process .About 90%

of M icrocy stis aer ug inosa cells cou l d be re m oved after 4days when the powder w as added at 1 10000(M /M )proportion .W hen the c h itosan -m od ified -algae -lysi n g -acti n o m ycetes -powder(C MALAP)w as added at 1 20000(m /m )proporti o n ,about 90%o f M.aeruginos a cells cou l d be floccu l a ted i n 0 5hour ,and 80%cou ld be lysed after 4days .The resu lt i n dicated t h at the C MALAP could not only prec i p ita te algae in short ti m e ,but also caused algae -lysi n g i n l o ng ter m ,w hich i m p lied t h at t h e po w der had an ex cellent foreg r ound in alga-l contr o lli n g app lication.

K ey w ords M icrocystis aeruginos a ;algae -l y si n g ;actino m ycetes ;ch itosan 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670088);湖北省科技攻

关计划重大招标项目(2006AA305A04);武汉市科技攻关计划(20066002104);广州市采购科技项目资助(GPC -[2007]303)

收稿日期:2009-04-01;修订日期:2009-04-23

作者简介:唐晨(1986~),男,硕士研究生,主要从事微生物控藻技

术的研究。E-m ai:l 6tangchen1985@163.co m

*通讯联系人,E-m ai:l chengkai cn@163.co m

随着城市化和工农业生产的发展,大量富含氮、磷等营养物质的城市污水、工农业废水流入湖泊、河口等缓流水体,使水体中营养物质迅速富集,引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖,水体溶氧量下降,水质恶化,鱼类及其他生物大量死亡的现象就是水体富

营养化现象[1]

。随着水体富营养化的加剧,藻类所引起的水污染问题已越来越引起人们的关注,淡水

藻类污染已成为一个全球性的环境卫生问题[2]

,针对我国湖泊面临的严重富营养化问题,在湖内污染源、流域点源与面源污染控制需要投入巨大资金且短期内难以取得成效的情况下,探索控制浮游藻类生物量和抑制 水华 发生的有效途径是非常必要的[3]

。而溶藻微生物(Alg icidal m icroor ganis m )是

水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分。由于微生物具有易于繁殖的特点,近年来,利用微生物防治有害藻类的方法逐渐得到重视

[4]

。溶

藻微生物可通过多种方式直接或间接溶藻[5,6]

,其

中,分泌胞外溶藻物质是微生物溶藻的主要方式之

一。利用溶藻微生物分离筛选高效、专一、绿色的溶

藻活性代谢产物,最终开发高效、安全的溶藻制剂已

成为治理藻类水华问题的新思路[7]。本实验室分

离得到了一株通过分泌胞外物质溶藻的放线菌[8],

并对该菌进行了发酵工艺生产,制备所得的溶藻粉

剂具有溶藻效果稳定,维持时间长的优点,但同时也

具有见效慢的缺点。与此相反,改性粘土除藻法具

有见效迅速,原料来源充足,天然无毒,使用方便,耗

资少的优点[9,10],但其并不能直接致死铜绿微囊藻,

其有效维持的时间也较短。因此将溶藻粉剂技术与

改性粘土除藻技术相结合,使二者优势互补,开发见

效快,维持时间长的新型控藻技术将具有明显的实

际应用价值。

1 材料与方法

1 1 实验材料

1.1.1 溶藻放线菌粉剂

本实验室分离得到了一株高效溶藻放线菌

AN02[8],通过工业发酵大规模生产后再通过板框过

滤技术滤除菌体,将所得无菌滤液添加一定比例的

无机载体高岭土后采用喷雾干燥法制得溶藻放线菌

粉剂(以下简称粉剂)。

1.1.2 藻种及培养

铜绿微囊藻7820(M icrocy stis aeruginosa7820):

来自中科院水生生物研究所藻种保藏中心,28 恒

温、2000lx光照培养,光暗比16h 8h。

1.1.3 培养基

铜绿微囊藻用BG11培养基培养[11],BG11培

养基:N a NO3150m g,K2HPO4 3H2O4m g,M gSO4

7H2O7 5m g,CaC l2 2H2O3 6m g,柠檬酸

0 6m g,柠檬酸铁铵0 6m g,EDTA0 1m g,N a CO3

2m g,A51mL,单蒸水定容至100mL(A5:H

3BO

3

286m g,M nC l2 4H2O181m g,ZnSO4 7H2O 22 2m g,CuSO4 5H2O7 9m g,N a M o O4 5H2O 39m g,Co(NO3)2 6H2O4 94m g,单蒸水定容至100mL)。

1.1.4 壳聚糖

武汉远城科技发展有限公司提供(工业级壳聚糖,脱乙酰度60%)。

1.2 分析方法

1.2.1 叶绿素a含量的测定[12]

取待测藻液5mL,经10000r/m i n离心10m in 后收集沉淀,加入5mL90%的甲醇溶液在闭光4 条件下保存1h。经11000r/m i n离心10m i n,取上清液在665n m波长处测定其吸光值(A665nm),所得A665nm值可由相应的换算关系式换算为叶绿素a的含量(ch-l a=13 9 A665n m,单位:m g/L)。

1.2.2 浊度(NTU)的测定

参照文献[13],用紫外可见分光光度计(日本岛津UV-2401)在680nm波长处测定。

1 3 实验方法

1.3.1 壳聚糖溶液的准备及高岭土的处理

称取90m g壳聚糖,加入20mL单蒸水,然后滴加少量的冰醋酸不断振荡或搅拌使之溶解,最后用单蒸水补足体积至30mL,得到3m g/mL的壳聚糖醋酸溶液。实验所用高岭土都经研磨,180目筛分,粒度小于74 m,干后使用。

1.3.2 菌体发酵液上清液p H稳定性实验

将AN02菌株的发酵液10000r/m i n离心10 m in收集上清,然后将上清液分别调节p H值为3、5 5、8 5和10,30m i n后,回调至中性,然后分别将处理过的上清液和未处理过的上清液按1/100的体积比(V/V)加入BG11培养的100m L铜绿微囊藻液中进行溶藻实验,每组设3个平行,以添加1m L AN02菌株的无菌培养基的藻液作为对照,于4d后测定叶绿素a的含量。

1.3.3 粉剂最佳直接投放比例溶藻实验

将粉剂分别按1 8000,1 10000,1 12000, 1 14000的质量比(M/M)直接投入BG11培养的100m L铜绿微囊藻液中进行溶藻实验,每组设置3个平行,以添加1m L AN02菌株的无菌培养基的藻液作为对照,于4d后取样,分别测定叶绿素a 含量。

1.3.4 未改性粉剂在短时间内的溶藻效果

将粉剂分别按1 10000的质量比(M/M)直接投入B G11培养的100mL铜绿微囊藻液中进行溶藻实验,每组设置3个平行,以添加1mL AN02菌株的无菌培养基的藻液作为对照,分别于2、4、6和12h在液面下2~3c m处取样测定叶绿素a含量。

1.3.5 改性粉剂及改性粘土的短时间控藻效果测试

将粉剂与高岭土各取0 01g加入300 L浓度为3m g/m L壳聚糖溶液中形成匀浆,将此匀浆接入200mL铜绿微囊藻液中,同时快速摇晃三角瓶使其充分混匀,静置后,逐时于液面下2c m处取样,测定样品的浊度(NTU)和叶绿素a含量。每组设置3个平行,以添加1mL AN02菌株的无菌培养基的藻液

757

环境工程学报第4卷

作为对照。

1.3.6 改性粉剂及改性粘土的长时间控藻效果测试

将粉剂与处理后的高岭土各取0 01g 加入300 L 浓度为3m g /mL 壳聚糖溶液中搅拌成匀浆,将此匀浆接入在三角瓶中用BG11培养的具有一定浓度的200m L 铜绿微囊藻液中,每组设置3个平行,以添加1m L AN02菌株的无菌培养基的藻液作为对照,同时快速摇晃三角瓶使其充分混匀,静置。4d 后摇晃三角瓶使藻液均匀混合后取样,分别测定叶绿素a 含量。1.3.7 急性毒理实验

在1000mL 的烧杯中加入1000mL 的曝气天然湖水,每个烧杯中随机选取生长良好的斑马鱼4尾。称取粉剂5g 溶于100mL 水中,并不断搅3h 使其充分混匀溶解,离心去除杂质,将上清液按照1 350、1 400、1 450的体积比(V /V )接入烧杯中。测得水温25 ,正常通气。测量得水体p H 值为6 5。同时设置空白对照组,96h 后观察斑马鱼的存活情况。

2 结果与分析

2.1 发酵上清液p H 稳定性实验

由图1可知在3、5 5、8 5和10的p H 梯度下,发酵上清液对铜绿微囊藻的溶藻效果分别为50%、30%、55%和65%

。图1 溶藻活性物质的p H 稳定性

F i g.1 Stab ility o f a l gae -l y si ng substances a t diff e rent p H

由此可见,在不同的酸碱条件下,AN02的发酵上清液均具有一定的溶藻效果,但在碱性条件下,其溶藻效果优于酸性条件。

2.2 粉剂最合适直接投加比例

在初始叶绿素a 浓度0 227m g /L 下,由图2可知在1 8000的投加比例下溶藻效率为92 47%,

1 10000的溶藻效率为90 41%,而1 12000的溶藻效率为8

2 19%,结果随着投加量的减少溶藻效果会随之降低。

图2 4d 后不同投加剂量粉剂的溶藻效果F ig 2 L ysi ng effect of d ifferen t propo rtions

o f the po w de r added after 4days

在投加量实验中可以看出1 8000和1 10000

的溶藻效果相差仅为2%,而1 10000和1 12000之间的溶藻效果则相差了近10%,综合考虑产品的应用成本和溶藻效果,选择1 10000(即10L 水中投放1g 粉剂)的投加比例。

2 3 未改性粉剂在短时间内的溶藻效果

由图3可以看出,溶藻放线菌粉剂在短时间内不会对铜绿微囊藻的生长产生任何影响。说明此粉剂不能在很短的时间内控制铜绿微囊藻的生长,只

能在一定时间后发挥其溶藻的效力。

图3 粉剂的短时间溶藻效果F i g .3 L ysi ng e ffect o f the power i n short ti m e

2.4 改性粉剂及改性粘土的短时间控藻实验

因为铜绿微囊藻液中除藻细胞外其他影响浊度的因素很小,故浊度的降低可代表藻细胞的去除[9]

。由图4可见,本产品经壳聚糖包覆改性后0 5h 对藻细胞的絮凝沉降效果可达到92 10%,2h 可达到97 70%。因为藻细胞能在短时间内被絮凝沉降,故叶绿素a 值也能在短时间内迅速下降,0 5h 的去除率达到了92 97%。

758

第4期唐 晨等:溶藻放线菌改性制剂对铜绿微囊藻的控

藻能力研究

图4 改性粉剂与改性高岭土在短时间内对浊度的

影响及对铜绿微囊藻的絮凝沉降效果

F i g .4 T urb i d it y changes and a l g al floccu l a ti on effec t by m odifi ed powder and m odified kao line i n short ti m e

由图4可以看出,粉剂改性后在浊度和叶绿素去除方面都要强于普通粘土改性。由于藻细胞能在短时间内被絮凝沉降,因此能够快速恢复水体透明度。而壳聚糖是一种性能优良的天然高分子絮凝剂,由于其具有无毒、无污染、安全性等优点在水处理中显示了其独特的优越性[14]

。

2 5 改性粉剂及改性粘土的长时间控藻实验

在初始叶绿素a 浓度0 459m g /L 下,由图5可以看出2种改性絮凝剂同在1 20000的投加比例下,改性粉剂在4d 后对铜绿微囊藻的去除率达到了80%,而高岭土改性制剂对铜绿微囊藻的去除率只有19%。

添加改性粉剂4d 后铜绿微囊藻的浓度已经降低了80%,而粉剂的有效作用依然还在持续,在实验室连续观察10d 后依然没有出现铜绿微囊藻再次生长的迹象。可能是粉剂溶藻效率在一定时间后达到了100%或是此环境已经不再适合铜绿微囊藻的生长。此改性粉剂已经在滇池开展了应用示范并取得了较好的实际应用效果。

粉剂改性后则既能在短时间达到较好的絮凝沉

图5 改性粉剂与改性高岭土4d 后的溶藻效果

F i g .5 A l g al re m ova l e ffect by modified powder and m odified kao li ne after 4days

降效果,又能在一定时间内起到较好的溶藻作用。而且由于絮凝后铜绿微囊藻与粉剂混合结成团状,

使得藻细胞周围单位体积内的溶藻物质浓度得到了大幅度提高,故在粉剂的投加比例比单独使用缩小了一半后仍能达到较好溶藻效率。使得其具有良好

的应用前景。

2.6 斑马鱼急性毒理实验

前述的实验结果显示粉剂的最佳投加比例是1 10000(即100m g /L),而斑马鱼急性毒理实验的结果显示当粉剂的投加剂量为222、250及286m g /L 时,斑马鱼均未出现死亡。说明在最佳投加比例下,

粉剂对鱼类等水生动物的急性毒性较低,在水华的治理过程中拥有较好的应用前景。

3 讨 论

普通的溶藻细菌的投加比例多在1 10~1 100(以质量比计),6d 左右才能达到较好的溶藻效果

[15,16]

,而本粉剂在投加比例低至1 10000时,仅

需4d 即可达到90%的藻细胞去除率,说明其溶藻能力更强,具有很高的应用价值。水华爆发时的水体一般呈碱性,粉剂在p H 为10的时候依然能够达到较好的溶藻效果且本身为不含活菌的纯生物制剂,无引入外来种的风险,生态安全性高。但本粉剂的溶藻效果见效较慢,投加后12h 内不能有效抑制铜绿微囊藻生长。

经壳聚糖改性的高岭土对铜绿微囊藻具有快速的絮凝沉降效果,投加2h 后的藻类去除率即可超过97%,这与邹华等

[9]

的结果是吻合的。但是,絮

凝技术本身是不具备溶藻效果的,本次实验的结果也显示,絮凝4d 后,铜绿微囊藻的叶绿素a 仅下降

759

了19%,可见其溶藻效果非常有限。考虑壳聚糖在自然环境下是易被降解的[17],因此,一旦壳聚糖被降解后就会失去粘架作用[9],残存的藻细胞会再次上浮,增加了水华再次发生的风险。

而本粉剂经过壳聚糖包覆改性后既能在短时间絮凝沉降藻细胞(2h就能沉降97.70%的铜绿微囊藻细胞),又能在4d后产生较好的溶藻效果(叶绿素a降幅达80%),而且此粉剂在长时间(至少10d)的溶藻效果依然很稳定。显然,粉剂自身所具有的溶藻能力是造成这一现象的主要原因。此外,由于絮凝后铜绿微囊藻与粉剂混合结成团状,使得藻细胞周围单位体积内的溶藻物质浓度得到了大幅度提高,故在投加比例为1 20000时亦可达到80%的溶藻效率,而未经改性的粉剂则需要高于1 14 000的投加比例才能达到同等的溶藻效果。

综上所述,改性溶藻放线菌粉剂能够集成生物溶藻与絮凝沉降除藻的优点,既能快速沉降除藻,也能长期有效控藻,具有更为广阔的应用前景。

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