植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定

植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定

    一、原理

    抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸； 多酚氧化酶可催化

空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。

    因此， 在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入抗坏血酸及焦

儿茶酚， 可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶的活性。抗坏

血酸的消耗量， 可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。碘酸钾在酸性条件下与碘化钾反应放出碘，

放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝色。

    二、材料与设备

    材料：马铃薯块茎

    设备：水浴锅、台秤、离心机

    试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、10％三氯乙

酸、1％淀粉。

    0.05mol/L碘液： 碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水， 加冰醋酸1ml，  再加0.1mol/L碘酸钾

12.5ml，定容至250ml。

    三、试验步骤

    （一）  酶液制备：

    称取马铃薯块茎10.0g， 用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，定容至50ml，

在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上清液，4℃保存备

用。

    （二）  酶活性测定：

    １. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)：

  ┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬─────┐

  │瓶号│ 蒸馏水 │0.1％抗坏血酸 │0.02mol/L焦儿茶酚 │ 酶 │煮5分钟酶 │

  ├──┼────┼───────┼─────────┼──┼─────┤

  │ 1  │   4    │     2        │                  │ 2  │          │

  │ 1' │   4    │     2        │                  │ 2  │          │

  │ 2  │   4    │     2        │                  │    │    2     │

  │ 3  │   3    │     2        │       1          │ 2  │          │

  │ 3' │   3    │     2        │       1          │ 2  │          │

  │ 4  │   3    │     2        │       1          │    │    2     │

  └──┴────┴───────┴─────────┴──┴─────┘

      1、3瓶各作一次重复，2、4瓶作空白

    将6个三角瓶放入18-20℃水浴反应5分钟,立即分别加入10％三氯乙酸1ml，摇匀，终止酶

反应。

    ２. 滴定

    冷却后， 分别加入3滴1％淀粉（马铃薯可不加，因其本身含的淀粉已足够），用碘液滴

定至蓝色。

    ３. 计算

    A. 抗坏血酸氧化酶活性＝[2号瓶滴定毫升数－1号瓶滴定毫升数]×Ｋ

    B. 多酚氧化酶活性＝[(4号瓶滴定毫升数－3号瓶滴定毫升数)×Ｋ]－A

               酶提取液总量(ml)×0.44

      Ｋ＝ ---------------------------------------------

           测定时酶液用量(ml)×样品重(g)×测定时间(min)

    0.44为每毫升0.005mol/L碘液氧化抗坏血酸的毫克数， 两种酶的活性单位均用每克干重

每分钟氧化抗坏血酸的毫克数来表示。