生物技术实验1

1  实验目的

(1)熟悉酶的固定化技术和原理。

(2)掌握糖化酶的固定化操作。

2  实验原理

  明胶含有赖氨酸ε-NH2，N-末端氨基，为戊二醛双功能交联提供了反应基团。通过双功能试剂的作用，明胶与糖化酶之间形成共价键，使糖化酶彼此交联，凝集成网状结构。但是单独使用时，由于这种凝胶缺乏足够的物理稳定性，所以必须加入交联剂甲醛或戊二醛，以增强其机械稳定性。戊二醛含有两个醛基，可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生反应，相互交联而使固定化酶硬化，由于明胶聚合物已将大部分游离酶包埋起来，因此这种交联主要发生在明胶与戊二醛之间，使固定化酶的使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高。

3  仪器和试剂

3.1  主要仪器 

    磁力搅拌器，pH计，水浴锅，500mL烧杯，50mL注射器，12号注射器针头，冰箱。

3.2  药品及配制

（1）所需药品：糖化酶，明胶，戊二醛，生理盐水。

（2）活力单位为70U/mL的糖化酶酶液300ml：用所给糖化酶配制（全班用量）。

（3）浓度为10%的明胶溶液150ml：称取明胶15g，放入装有150mL蒸馏水的烧杯中，静止10分钟，水浴加热使明胶溶解，注意水浴的温度不超过70℃。

（4）5％的戊二醛溶液300ml。

4  实验操作

  方法一：戊二醛直接凝固法

1、将明胶加热溶于水，冷却至40℃；

2、将150mL明胶溶液与15mL糖化酶液混合均匀，使明胶的最终浓度为10%左右；

3、直接在明胶与糖化酶混合液中加入150mL戊二醛，搅拌均匀，然后使其凝固；

4、将凝胶切成大约3mmX3mmX3mm的小方块，用生理盐水洗净，0~5℃冰箱中储藏备用。

方法二：明胶包埋-戊二醛交联法

1、将明胶加热溶于水，冷却至40℃；

2、将150mL明胶溶液与15mL糖化酶液混合均匀，使明胶的最终浓度为10%左右；

3、将明胶溶液与糖化酶混合液凝固，然后将凝胶切成大约3mmX3mmX3mm的小方块；

4、然后用30℃ 5％的戊二醛溶液中进一步硬化1h；

5、滤出固定化颗粒，用生理盐水洗净，0~5℃冰箱中储藏备用。

5  实验结果

观察所得固定化糖化酶的色泽和形状，测量其体积和沥干水后的重量，把所得各项指标填入下表：

表1  所得固定化糖化酶的外观、体积和质量

1．本实验的固定化方法是所述哪几种酶固定化方法的结合?