琼胶酶降解菌的筛选纯化及其产酶特性分析

章宗铭，桑卫国，洪小伟

宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波 (315100)

E-mail：sangweiguo@nbu.edu.cn

摘要：本实验从腐烂紫菜中筛选出了10株具有降解紫菜的能力的海洋细菌，并利用琼胶酶作为评价指标用DNS法对其胞外酶活力进行了测定，从而获得了一株酶活力较高的菌株DT-7，通过测定其生长曲线，产酶曲线以及还原糖含量曲线得出DT-7在24小时菌体密度和还原糖含量最高，36小时左右产酶达到最高，酶活力最高达到472U/ml。该菌株在琼脂作为唯一碳源的培养基中能够正常生长，并在4-5天的生长后，琼脂上产生大量的水解坑，在培养15天左右整个琼脂都被液化。将该菌株进行产酶发酵，经过粗分离获得粗酶，利用该酶来降解紫菜获得紫菜原生质体，获得了很好的效果，因此也为紫菜的育种提供了直接的材料。

关键词：琼胶酶；DNS；生长曲线

琼胶主要从石花菜、江篱、鸡毛菜等红藻中提取分离，由琼胶糖(agarose)和硫琼胶(agaropectin)组成，琼胶糖是由1,3 连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4 连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖[1]。硫琼胶结构较复杂，含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸[2]。琼胶酶能降解琼胶多糖，生成琼胶低聚糖，这些降解产物在食品领域均有良好的应用前景。而且，琼胶酶在PCR 产物回收等方面也极具应用价值。近年来，随着糖生物研究及低聚糖制备技术的不断发展，低聚糖的巨大潜力受到越来越多的关注，已成为多糖高值化及新药、新功能性食品、新化工品等研究的热点。虽然琼胶低聚糖的研究还远落后于肝素等糖类，但韩国、日本已对琼胶酶及其水解产物的生物活性功能已有一定的研究，证明了一定聚合度的琼胶低聚糖具有重要的应用价值和开发前景[3]。由此看来，开展琼胶酶的研究具有一定的科学意义和社会效益。在本实验中，作者从腐烂紫菜中分离到一株高产琼胶酶的海洋革兰氏阴性菌，并对这株菌进行了鉴定和产酶条件的优化[4]。

1. 材料与方法

1.1 培养基及试剂

富集培养基:2216海洋细菌培养基(g/l): 蛋白胨 5,酵母膏 1,磷酸高铁 0.1,琼脂 2,陈海水1000ml, pH 7.5

平板斜面富集培养基(g/l): 琼脂 15,其它则同2216培养基

平板分离培养基(g/l): 琼脂20, NaCl 25, MgSO4.7H2O 0.5, NaNO3 2,K2HPO4 1,FeSO4.7H2O 0.02,CaCl2 0.2, pH 7.5

液体种子培养基(g/l): 琼脂 2,NaCl 25, 蛋白胨 5,酵母膏 10,FeSO4.7H2O 0.1,自来水

1000ml ,pH 7.5

发酵培养基(g/l): 琼脂 2,NaCl 25, 蛋白胨 5,酵母膏 10,FeSO4.7H2O 0.1,自来水

1000ml ,pH 7.5

DNS 试剂: 6.3克的3，5-二硝基水杨酸，262ml 2mol/l的NaOH加到500ml含182克的酒石酸钾钠的热水溶液中，然后加入5克苯酚和5克亚硫酸钠，待冷却后用蒸馏水定容到1000ml，存于棕色瓶中一周后即可使用。

1本课题得到农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室(KFT2006-2)的资助。

1.2 取样及处理方法

用无菌容器于温州洞头某紫菜养殖场取少量的腐烂紫菜，取1g左右的紫菜加入盛有l0ml 无菌海水的试管中，摇匀后取5ml于25ml富集培养基的三角瓶中，25℃, 150rpm摇瓶培养。培养48h后，移取5ml培养液至另一盛有新鲜培养基的三角瓶中继续培养48h。

1.3 初筛和复筛

将富集培养的菌液用无菌水适当稀释，取0.2m1涂布分离平板。23℃培养72h，将有明显透明圈的菌落，挑取10株到斜面种子培养基上保藏，供初筛用[5]。将平板分离到的菌株从新鲜斜面上用无菌水洗下，经适当稀释后涂布在初筛培养基上，23℃培养72h，将有明显透明圈且较大的菌落挑至斜面种子培养基上保藏，供复筛用。将初筛得到的10株菌种分别从种子斜面培养基上挑取适当量，分别接种到10个三角瓶的种子培养基（100ml）中，在25℃条件下以150rpm的转速摇床24h；再将培养得到的种子液取10ml分别加入到10个三角瓶的发酵培养基中（90ml），在25℃条件下以150rpm的转速摇床48小时，将所得到的发酵液离心，制得粗酶液，测定其酶活力，筛选出产酶活力高的菌株。

1.4 粗酶液的制备

将发酵培养所得到的发酵液，经过4℃条件下1500g离心20min，获得上清液作为粗酶液，稀释10倍，用于酶活力的测定。

1.5 DNS测定还原糖标准曲线的制作

准确称取100mg半乳糖(预先在105℃干燥至恒重)，用少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，定容，摇匀，浓度为lmg/mL。取九支25mL具塞比色管，按下表(表1)分别加入试剂，将各管溶液混合均匀后，沸水浴中加热5min，立即用冷水冷却到室温，分别定容到25mL，摇匀，于520nm处测光吸收值。

表1半乳糖标准曲线的制作

Table 1 Preparation of standard curve for D一galactose

管号项目0

1 2 3 4 5 6 7 8

半乳糖标准溶液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水(ml) 2.0

1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS(ml) 1.5

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

沸水浴中加热5min，立刻用冷水冷却

定容(ml) 25

25 25 25 25 25 25 25 25

图1 半乳糖标准曲线图

Fig.1 standard curve for D- galactose

1.6 发酵液中还原糖及其酶活力测定

用pH7.4的Na2HPO4—柠檬酸缓冲液配制0.3%的琼胶底物溶液200ml。取三支比色管分别记为A,B,C。在A和C中加入1ml粗酶液，B中加入1ml未接菌种的发酵液。将AB两管放入沸水浴中加热5分钟使其灭活。然后在三支比色管中加入1ml的底物，放入40℃水浴条件下,反应30min。30min后将其取出，各管加入1.5ml的DNS试剂煮沸显色5min，在用蒸馏水定容至25ml。在波长520nm处测定光吸收值，测还原糖时用B作对照，测A的吸光值，测酶活时用A作对照测C的吸光值。根据标准曲线确定产生还原糖的量[6]。

酶活力单位定义:在上述反应条件下，1ml酶液每分钟产生lµg还原糖作为一个酶活力单位。酶活公式:酶活力U/m1= 2A/0.6602 * 1000*n/t 式中：A表示吸光值， 0.6602表示标准曲线的斜率，n表示酶液稀释的倍数，t表示反应时间。

1.7 琼胶酶产生菌生长曲线，产酶曲线以及还原糖曲线的测定

在72小时发酵过程中，每隔4小时取出一定量的发酵液，1500g离心20分钟除去上清液，然后在离心管中加定量的蒸馏水将沉淀菌体混匀，在620nm下，以蒸馏水为空白，测其吸光度[7]。产酶曲线和还原糖曲线亦是每隔4小时取出测一次，方法如1.5所述。

1.8 酶解紫菜获得原生质体

将新鲜的紫菜经无菌水清洗后，切成细小的碎片，加入到容器中，再将发酵所得到的上清液取出2 mL加入1 mL蒸馏水、1 mL 2.5 M葡萄糖溶液、1 mL 0.2%的CaCl2溶液构成酶液在30℃条件下酶解2小时，在每隔30min取出少量紫菜，在显微镜下观察紫菜酶解的情况[8]。

1.9 菌落形态观察

将经过筛选所确定的菌株，平板划线28℃分别培养24h 和48h，革兰氏染色后，观察菌落形态。

2. 结果和分析2.1菌株的筛选

本实验从烂紫菜中筛选出的菌种经过琼胶酶活力的测定，具有较高的酶的活力，具备了一定的生产性能，具有作为进一步研究对象的潜力。在分离平板上长出的菌种，经过4-5天后便会产生凹陷(图2)。因为分离培养基上的唯一碳源仅是琼胶，便可初步认为该菌为可产琼胶酶的降解菌，为进一步证实，将选出10株具有较强降解琼胶能力的原始菌株进行复筛，将其分别接种至液体培养基中，于25℃150 r/min 振荡培养48 h，检测发酵液的产酶活力。其中DT-7 菌株在两种复筛培养基中都表现出最高的产酶活力(图3)

图2菌株在平板培养4天后出现的水解坑

Fig.2 after 4day scultivated,the hollow appeared

图3 10株菌48小时后的酶活

Fig.3 ten different bacterium’enzyme activity after 48hours fermented

2.2 菌株DT-7的生长曲线

对菌株DT-7进行25℃，150r/min摇床培养，每隔4h测定发酵液的光密度，根据光密度的变化作出该菌株的生长曲线，如图4。由图可知在24小时左右菌体密度达到最大值。

图4 菌株DT-7的生长曲线

Fig.4 growth curve of DT-7

2.3 发酵液还原糖及其酶活力曲线测定

在发酵过程中，细菌利用琼胶作为唯一碳源，先将其酶解为还原糖再进行利用，以下是细菌在72小时发酵中的酶活曲线和还原糖曲线(图5)

图5 酶活曲线，还原糖曲线

Fig.5 curve of enzyme’s activity and reductive sugar

▲—还原糖曲线curve of enzyme’s activity

■—产酶曲线curve of reductive sugar

由表上图可知，发酵液内的产酶曲线与还原糖曲线便不相同，菌体在发酵20小时的时候，发酵液当中的还原糖含量最高，而在发酵32小时左右发酵液内的酶含量是最高的，根据公式换算成酶活最高可达472U/ml。

2.4 酶解紫菜获得紫菜原生质体

将新鲜的紫菜碎片使用粗酶液进行酶解，经过两个小时的酶解，获得大量的紫菜原生质体，酶解过程中的不同时间酶解情况在显微镜下的图象如以下图所示，得到的效果是很令人

满意的。

图6 碎后的紫菜细胞，细胞重叠，排列紧密

Fig.6 shredding the laver cells, cells overlaps closely with

图7 酶解半小时，内部细胞 图8 酶解一小时，边缘细胞脱落

Fig7 Hydrolysis one-hour, Fig8 Hydrolysis one-hour,edge

Internal cells cells exfoliated

图9 酶解90分钟，大紫菜片 图10 酶解两小时，游离细胞团

Fig9 Hydrolysis one an a half Hours Fig10 Hydrolysis two hours, free cells

2.5 菌落形态观察

菌株DT-7能在平板上生长，形成规则的圆形菌落，表面光滑湿润，边缘整齐，培养24h 菌落直径约为3mm 。培养72h 出现明显的水解圈。革兰氏染色为阴性，细杆状。

3. 讨论

本实验从腐烂紫菜中成功的筛选到了能够使紫菜降解的菌种，该菌株能够在琼脂作为唯

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一碳源的培养基中正常生长，在并且在培养4-5天后在培养皿中的琼脂上出现了大量的水解坑，在培养15天左右能够将整个琼脂液化。这说明了该菌株能够产生分解琼脂的酶—琼胶酶，这正是本实验用以评价菌株产酶的一个最主要的指标。由于对分离筛选出的DT-7进行生长曲线，产酶曲线，以及还原糖曲线的测定使得对该菌体的一些生理条件由了初步的了解，对进一步研究该菌种提供了良好的基础。而且该菌种产生的酶能够降解紫菜细胞，这对于紫菜植株的病害以及种质改良的研究也有一定的实际意义。

参考文献

[1] 杜宗军,王祥红,李筠,等. 琼胶酶研究进展[J].微生物学通报,2003 ,30 (1)：-67.

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31(7):8-14.

[4] 马悦欣,安军,刘双连等.仿刺参消化道内产琼胶酶菌株的选育及培养条件优化[J].大连水产学院学

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[5] Jean H. Erasmus, 1997. The role of bacteria in the digestion of seaweed by the ablone Haliotis[J].

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[6] Wang J, Mou H, Jiang X, Guan H. Characterization of a novelβ-agarase from marine Alteromonas sp.

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from Agarivorans albus YKW-34 Kim Appl Microbiol Biotechnol (2008) 78:265–273

Screen of Bacteria which can produce agar-decomposing enzyme and the judgement of it’s property

Zhang zongming, Sang weiguo, Hong xiaowei

ningbo university, ningbo (315211)

Abstract

The experiment has screened 10 strains marine bacteriums, which have the ability of decomposing the laver.,we used the DNS method measuring the agar-decomposing enzyme as a main index for evaluating the capability of decomposing the laver.as a result ,the strain of DT-7 is screened ,which has a high activity of the extracellular enzyme. through the determination of growth cruve and the curve of enzyme’s activity and reductive sugar, we made a conclusion that the strain of DT-7 Extracellular enzyme activity of Agar reached 472U/ml, with a certain amount of capacity. The strain can normal growth using agar as the sole carbon source medium and after the growth of 4-5 days, agar massive was hydrolysised with the appearance of a great amount of holes. After training for 15 days, the entire agar was liquefied. We used this strain to ferment to produce enzyme,and we separated the enzyme roughly from the fermentation broth. Then we used the enzyme to hydrolyze the laver to obtain the laver protoplasts,as a result we gain very good results, which has paved the way for the breeding of the laver.

Keywords: agar-decomposing enzyme; DNS; growth curve

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