清除自由基能力的研究概况

              陶涛

（西南林业大学林学院  农学（药用植物）昆明  650224）

摘 要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 

关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化 ．

Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria

                 on free radical

  bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and

foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 

                引 言

    氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说， 是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的 氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是 由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。

    自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢 过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人 体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、羟自由 基(Ho一)、和过氧化氢(H202)，通称活性氧(active oxy— gen spieces)tn。随着自由基医学和自由基生物学的发 展。人们认识到自由基具有很高的反应活性。它可对 机体产生毒害，破坏生物大分子，影响细胞活性，主要 损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及亚微结构．并引起一系列有害的生化反应。现代医学研究已经证明。自 由基与许多病理生理现象都有着密切的关系。如衰 老、肿瘤、炎症、突变、心脑缺血、动脉粥样硬化、帕金 森等病症醐。 

乳酸菌是指一群通过发酵糖类产生大量乳酸的 细菌总称。从形态上可分为球菌和杆菌，并且多数为 革兰氏染色呈阳性、不形成芽孢、不运动、过氧化氢酶 试验呈阴性、对葡萄糖发酵能产生50％以上乳酸、而且 在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性细菌。在 工业、农业和医药等与人类生活密切相关的重要领域 应用价值较高，广泛应用于乳制品、蔬菜及肉制品的 发酵与防腐中。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸、双乙酰 和过氧化氢外．还能产生多种具有抑菌或杀菌生物活 性物质．在抑制各种病原菌和食物等方面起重要 作用．尤其是作为益生菌的重要成员之一倍受各界关注。

      近年来．国内外对乳酸菌的生理活性有大量的研 究报道。乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值。改善 食品风味．增加食品保藏和附加值．而且据有特殊生理活性和营养功能。大量研究表明。乳酸菌能够调节 机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡、降低血清胆 固醇、抗肿瘤和免疫赋活作用、可抑制肠道内菌 生长繁殖和产物的产生、增加营养、促进免疫能 力，从而对机体的生理功能、免疫反应、肿瘤发生、衰 老过程和应激反应等产生作用M。乳酸菌的抗氧化活 性也开始引起国内外大量专家学者的广泛关注。目前关于乳酸菌的抗氧化活性的研究主要集中在日本、 美国、澳大利亚及中国的等国国家和地区，研究工作集中在筛选具有抗氧化活性的菌株及其发酵乳的 抗氧化活性。

1 乳酸菌抗氧化的测定方法

     1．1抗脂质过氧化法 脂质过氧化反应是自由基攻击细胞膜上的多聚 不饱和脂肪酸(PUFA)而触发脂质过氧化(LPO)等一 系列链式反应p一。目前检测乳酸菌抗脂质过氧化的常 用方法是硫代巴比妥酸(TBA)法，脂质过氧化反应的 最终产物有丙二醛(MDA)。iDA可破坏蛋白质等生物 大分子。造成机体老化和多种疾病的发生。其含量与 多种疾病的发生及年龄的增长呈正相关．其性质比较 稳定，便于检测。因此．测定MDA的含量，在一定程度 上可反映脂质过氧化损伤的程度．是目前公认的反映 脂质过氧化的指标[n-131。丙二醛在酸性条件下可以与 硫代巴比妥酸(TBA)反应(室温反应5 h，不时摇动)生 成红棕色的三甲川。毛E532蛳处有吸收峰，可以计算 出MDA的量，从而得知脂质过氧化的情况【谰。为避免 过量的氧化物使三甲川褪色。可在加入TBA以前。加 入三氯醋酸或丁基化羟基甲苯阻断反应。TBA-法常用 于检测乳酸菌是否对生物体系(如红细胞、脂蛋白、组 织匀浆、肝微粒体、肝线粒体、肝细胞等)具有抗脂质过 氧化作用111．15tⅧ。

1．2清除二苯基苦基苯肼自由基的能力

1，1一二苯基苦基苯肼(1，1一diphenyl～2一picryl一 hydra别，DPPH·)自由基是一种很稳定的以氮为中心 的自由基．通过检测乳酸菌对DPPH·自由基的清除能 力可以表示其抗氧化能力的强弱。此法是依据DPPH· ；11E517 nm处有一强吸收和其乙醇溶液呈紫色的特性． 加入乳酸菌菌体细胞或无细胞提取物后．由于与其单 电子配对而使其吸收消失．在不同时间测定其清除 DPPH．而引起吸光度的减少可以反映其抗氧化能力 的强弱【仃-堋。若乳酸菌能清除它，则说明它具有降低羟 基等自由基和打断脂质过氧化链反应的作用刚。另外， 因为该自由基只有一个单电子．也可以应用电子自旋共振(ESP)法来检测。原理与羟基自由基的清除相 同[211。 

1．3清除羟自由基的能力 

生命活动的代谢过程所产生的自由基中，羟自由基(．OH)是体内最活泼的活性氧，氧化能力极强。因 此迫切需要加强清除羟自由基(·oH)作用的研究[221。 产生羟自由基(·OH)的体系主要是Fenton体系． 反应式为：Fe2++H20，Fe3++·OH+OH一，与之类似的 可以用CO”代替Fe2+-tfZ-会有相同的效果嘲。另外，其他 还有Fe”一EDTA—vc—H：o：体系、黄嘌呤一黄嘌呤氧化 酶一H：o：体系、紫外光照H20：光解也可产生羟自由基 (．OH)。其中Fenton体系是最常用的1201。 邻二氮菲-Fe2+是一常用的氧化还原指示剂．其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2o与Fe2+通过Fenton反应产生的羟自由基是一强氧化 剂。邻二氮菲一Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲一Fe后，其在536nm处的最大吸收减少。加入羟自 由基(·OH)清除剂后，羟自由基(·OH)的浓度减小。体系的吸光度会再次升高到一定程度。因此可以根据加入乳酸菌菌体或其无细胞提取物前后吸光度的变化来反映羟自由基(·OH)的生成与减少。 

1．4清除超氧阴离子自由基的能力

测定乳酸菌清除超氧阴离子自由基(o：一)一般采 用邻苯三酚自动氧化的比色分析法。邻苯三酚在碱性 条件下自动氧化并产生超氧阴离子自由基(o：一)和有 色中间产物，加入超氧阴离子自由基(o：一)清除物质后 会抑制有色中间产物的产生。可以通过比色的方法进 行定性和定量分析。因而可以根据加入乳酸菌菌体或 其无细胞提取物前后有色中间物质颜色的变化来反映超氧阴离子自由基(o：_)的生成与减少圆。虽然超氧阴离子自由基(o：一)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化．但它会在金属离子催化下 发生Fenton反应产生具有高活性的羟自由基(·OH)，因此常用样品对超氧阴离子自由基(02-1的清除能力来反映其抗氧化活性。

2乳酸菌抗氧化的国内外研究现状

Lln等㈣在研究中报道．在对19株乳酸菌包括嗜酸乳杆菌(L．acidophilus)、保加利亚乳杆菌(L．bulgancus)、嗜热链球菌(St．thermophilu0、长双歧杆菌(B．10ngum)的一些菌株的无细胞提取物进行抗氧化实验发现。所有的被研究菌株对抗坏血酸的自动氧化具有抑制作用．抑制的范围在7·％~12％；在金属离子鳌合能力方面，10'0-q" 活乳酸菌的无细胞提取物可鳌合Fe2+的量为(2．5"72．7) ×lO-6mg／L。其中嗜热链球菌821为72．7x10--6 mg／L。在清除羟自由基(·oH)实验中发现，10to个活乳酸菌的无细胞提取物清除羟自由基(·OH)能力相当于尿酸的量为0．5-33．1 mmol／L．其中嗜酸乳杆菌E为33．1 mmol／L。这19株乳酸菌都具有还原能力，但均没有发 现SOD酶的活性。

 Lin等[2Sl还在抗脂质过氧化实验中进一步发现长双歧杆菌ATCCl5708和嗜酸乳杆菌ATCC4356的细 胞对亚油酸过氧化反应的抑制率为28％～48％：对 DPPH的清除率为21·舻2％：对4一硝基哇琳一1一氧化物(4NQo)细胞毒性的抑制作用分别为90％和50％；对 老鼠血浆脂质过氧化反应的抑制率为11％---29％。但这两个菌株的无细胞提取物对4NQO的细胞毒性没有抑制作用。

 Talwalkar等㈣报道了．双歧杆菌有抗过氧化氢的 能力，并发现双歧杆菌的无细胞提取物有SOD酶、 NADH过氧化酶和NADH氧化酶活性。

 张江巍等1271报道．利用6种方法对两株乳酸菌L3和L4无细胞提取物的抗氧化性能进行了检测分析．发现 乳酸菌L3和L4鳌合Fe2+的水平分别为54．3×106和41．3X10s．清除超氧阴离子自由基能力分别为14．9％和87．0％，清除羟自由基的能力分别为83．5％和45．7％．并具有还原活性。

 孟和毕力格等例报道了酸马奶中的嗜酸乳杆菌 MG2-1菌株具有抗氧化活性．其活菌制剂能够使大鼠肝脏组织匀浆中SOD活力和GSH—Px的活力有明显 的提高，与对照组比较分别达到显著性fP<0．05)和极显著性(P<0．01)差异水平。脂质过氧化物的终产物丙 二醛的测定结果显示．嗜酸乳杆菌MG2--1菌株活菌制剂能够显著地降低大鼠血液和肝脏组织匀浆中丙二醛含量(p<0．05)。

 Kaizu等IaJXq*L酸菌的抗氧化特性进行了动物实验。两组缺乏维生素E的大鼠。一组饲喂乳杆菌 SBT2028的无细胞提取物和水：另一组饲喂维生素E (4 mg／d)。结果发现，喂养无细胞提取物和水的大鼠对血红细胞溶血作用的抑制率分别为91％和30％f维生素E组视为100％)：肝脏中MDA的浓度分别为250 nmol／g 和320 nmol／g(维生素E组为200 nmol／g)：血浆中维生素E的质量浓度分别为1．4 wg／mL和1．0斗g／mL(维生素 E组为2．4¨g／mY)。这说明乳杆菌SBT2028有抗氧化活 性．抗氧化效果和维生素E相近。

 闻平⋯等在研究明串珠菌L．SP．HXQ 001对家兔 抗氧化时发现．正常家兔在口H艮HXQ 001菌发酵物1 周后，红细胞SOD总活性及血清GSH—px活性明显增 高(P<0．05)，而血清MDA含量明显下降(P<0．05)。持 续口服该菌发酵物的结果显示．口服该菌发酵物可在 较长时间内维持soD和GSH—px活性衡定在较高水平．MDA在较低水平，提示口,q民HXQ 001菌发酵物可增强家兔的抗氧化能力。 

Kullisaar等Ⅲl报道了发酵乳杆菌ME一3在人体实验 (21名健康的自愿者，5名男性，16名女性．年龄为35～ 65岁)中显示出抗氧化活性。分别给这些人每天饮用150 g的新鲜羊奶和经发酵乳杆菌ME-3发酵的羊奶，3周以后对其血浆进行对比发现．饮用了发酵羊奶的人中低密度脂蛋白的氧化作用明显减少(P3 展 望

自由基生物学作为一门新兴的学科．其研究的重点一方面是与自由基有关的疾病的引发机理和控制手段，另一方面是自由基清除剂的筛选以及对某些疾病的治疗效果。我国是一个乳酸菌菌种资源非常丰富的国家。为筛选及研究有效的天然乳菌菌抗氧化剂提供了良好的条件。 研究已经证实．一些乳酸菌菌株具有抗氧化活性．虽然乳酸菌的抗氧化活性已经得到体外及体内实验的证实．但其抗氧化活性作用机制至今尚不清楚。 关于乳酸菌中的抗氧化物质的化学结构、性质、在肠 道中的吸收．以及在体内所起的抗氧化机制还需要做进一步的研究。发酵乳制品是人们摄入外源乳酸菌的一条重要渠道。筛选优良的、具有抗氧化活性和安全 的乳酸菌菌株。对于开发功能性乳制品、丰富现有乳制品的附加值具有重要意义。

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生物技术制药

                     专业:农学（药用植物）

             姓名：陶涛

                    学号：20100457040