RNA干扰及其在动物基因功能研究中的应用

苏光华,张元跃

(湖南农业大学动物科技学院,湖南长沙410128)

[摘　要]　RNA 干扰(RNAi )是指具有同源性的双链RNA 分子导入细胞后,使促进与之同源的mRNA 发生特

异性降解的现象。随着对RNAi 分子机制研究深入,它将成为研究动物基因功能、蛋白质功能、基因治疗、基因药物的强有力的工具。

[关键词]　RNA 干扰;　动物基因功能;　转基因

[中图分类号]　Q78　　　[文献标识码]　A 　　　[文章编号]　0163(2006)02-0080-04

RNA I nterference and Its Use in Animal G ene R esearch

S U G uang -hua ,ZH ANG Y uan -yue

(College o f animal science and technology ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,410128)

[Abstract]　RNA interferenc (RNAi ),a process of sequence -specific degradation of hom olog ous mRNA trig 2gered by double -stranded RNA 1Simultaneously ,Wieh the fureher study on m olecular manchnism of RNAi ,it will be 2come powerful tools in animal gene function research ,protein function ,genetreatment ,gene medicine 1

[K ey w ords]　RNA Interference ;　Animal G ene function ;　transgene

收稿日期:2006-05-08

作者简介:苏光华(1981-),男,湖南农业大学2004级动物遗传育种与繁殖在读硕士。研究方向为分子遗传学。

　　随着人类基因组计划的完成,后基因组时代已

经到来,基因功能的研究越来越重要。畜禽基因组计划的开展,为了解畜禽的基因功能提供了坚实的基础。科学家们急需找到研究基因功能行之有效的方法,基因敲除(knock out )不失为一种有效的方法,但是其复杂而费时、成本高、稳定性不高、不确定性,了其发展。最近兴起的RNA 干扰技术,以其快速、简便、高效的抑制基因表达受到科学家们极大的关注。RNA 干扰(RNAi )技术又名靶蛋白剔除(knock down )或靶基因,它是比基因敲除更有效研究基因功能的方法。RNAi 是一种序列特异性的转入后基因沉默机制(PTG S ),它通过一段双链DNA (dsRNA )导致同源mRNA 从而使目的基因失表达[1,2]。RNAi 是生物学界过去20年中最令人兴奋的发现,它是一种基因转录后水平基因表达的方式,1990年,Jorgensen [3]首次发现这种现象,广泛引起了人们的研究兴趣。

1　RNAi 的概念及其作用机制

RNAi 作用的机制:起初被认为与内源性的RNA 降解有关,与内源性基因同源的dsRNA 只降

解对应的靶mRNA ,而靶向基因的内含子或启动子没有明显的抑制效应[1],其表现出高度的序列特异性。Hamm ond 等科学家认为:靶mRNA 降解可能是与一种核酸酶有关[4]。这种核酸酶因此被叫做RNA 诱导的沉默复合物(RISC )。在RNA 及蛋白因子诱导下,它能诱导靶mRNA 的特异性降解。后来这种RISC 在果蝇细胞提取液RNAi 干扰是指通过正反义的RNA 片段形成双链RNA 从而特异的抑制靶基因转入后表达的现象中被证实。RNAi 作用机制目前被认为是以下三个步骤:

111　转录后的沉默机理　转录后基因沉默机制(PTG S )最初是在秀丽新小杆线虫及植物的研究中

提出的[5]。此过程涉及小干扰RNA (small interfer 2

08　　　　　怀化医专学报

JOURNA L OF H UAIH UA ME DICA L CO LLEGE 　2006,5(2)

11111　RNAi起始的效应阶段　在RNAi的起始阶段,加入约dsRNA大约被切割成22nt的具有双链结构的siRNAs。近年的研究中发现,siRNA是RNAi作用机制的重要中间效应分子[6]。这些siR2 NA具有5磷酸、3羟基,末端以及两个游离nt突出,从而在RNAi途径中起着关键的作用[6,7]。有证据表明,一种被叫做Dicer酶参与了此过程,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA。Dicer酶属于RNA酶Ⅲ家族,包含了许多重要的结构域。如N-末端解旋酶结构域(依赖ATP 酶活性)、PAZ结构域、双链RNA结合结构域[8]。最近,Blaszczyk等提出了Dicer酶的作用模式:他认为细菌RNA酶Ⅲ是一个二聚体,当反向平行排列的RNA酶Ⅲ基本序列与底物dsRNA结合后,能产生4个底物催化活性位点,但是中间两个位点活性丧失,两端活性位点催化底物间距约22nt。因此,Dicer结构有微弱变化即导致切割间距的改变,表现为siRNA长度的种属特异性。但是也有实验证明[9,10],在动物中Dicer酶可以将双链RNA分解为两类截然不同功能的微小RNAs:微小RNAs(miR2 NAs)和小干扰RNA(siRNA)。其中miRNAs调节mRNA的翻译,而siRNA则指导经RNAi途径对mRNA的破坏作用。

11112　RNAi效应阶段　在RNAi效应阶段,siRNA 结合到核酸复合物形成RISC,RISC激活ATP酶依赖的siRNA解双链的过程[11]。Z am ore[6]等科学家发现,从果蝇胚胎裂解液中提取的RISC是一个分子质量大约为25×103的前体,通过ATP酶激活后变成约10×103大小的活性复合物,酶活的RISC则与siRNA结合,并使之解旋、解链,然后在siRNA 的指导下,RISC通过碱基配对定位到同源mRNA 上,并在距离siRNA3/端12个碱基的位置切割mR2 NA,但切割的机理仍未弄清楚,有待进一步研究。11113　RNA解旋酶蛋白家族　在拟南芥中,位点编码类似Upflp家族的RNA解旋酶,Sde3突变将导致RNAi受阻。Upflp蛋白家族可能包括两类:一个是包括Sde3及来自人类、鼠及果蝇的蛋白;另外一类是包括Upflp及秀丽新小杆线虫的中同源物Smg-21Smg-2的C-末端富含半胱AA保守区域和S Q基序,但在Sde3RNA解旋酶中缺乏。因此, Sde3在功能上可能不是Upflp及Smg-2的同源物,但在秀丽新小杆线虫Smg-2和酵母Upflp间却具有较高的同源性,且Smg-2与非特异性降解及沉默效应的持续性有关。因此,到目前为止,关于Smg -2在RNAi途径中确切的生物学作用仍不清楚。11114　沉默信号的传递和放大　最新的研究资料表明,在秀丽新小杆线虫和拟南芥中,细胞内RDRP 以Dicer酶生成siRNA为引物,以靶mRNA为移动,即tRNAi模式[12]。尽管,这些模式表明了细胞自主性的系统沉默,信号的传递征仍不清楚。注意: RNAi在哺乳动物中可能存在非细胞性自主机理。112　蛋白质翻译水平　对秀丽新小杆线虫的研究表明:Dcr-1除RNAi抑制外,也会导致机体多种改变,如基因缺失、表型缺陷或者不育[7]。在增殖的哺乳动物细胞中大约有300个微RNA被证实。尽管微RNA能够持续表达,但是可能局限在发育的某个时期。比如;微RNA介导了机体的空间发育、压力反应或细胞周期调解,但是在哺乳动物中,多数微RNA的产生是阶段或组织特异性。

113　RNA介导和基因组DNA的甲基化　在植物中dsRNA诱导了同源序列基因组DNA的甲基化[13],然而甲基化是不对称的,而且不仅仅局限于C p G 或者C pX p G序列。如果甲基化发生在编码区,可发生PTG S,对转入没有明显的影响;如果发生在启动子区,则诱发转入水平基因沉默(transicrip2 tional gene silencing,TG S)。因此,dsRNA可以介导基因组水平的甲基化,但是其程度和性质尚不清楚,有待进一步研究。

2　RNAi在动物研究中的应用

211　RNAi在哺乳动物基因功能研究中的应用　在基因功能的研究方面,目前应用的方法有反义RNA 技术抑制转入、核酸技术来除去细胞内的mRNA、培养细胞内显微注射特异性抗体,或者通过特异性的结合抗体同细胞表面的受体结合来抑制蛋白质的功能,从而研究基因的功能。RNAi技术与这些技术相比具有自己独特的优势。RNAi技术能使基因沉默不表达或以极低水平表达,而且操作相对简便、快捷,费用也比传统的基因敲除低廉,因此是一种快速有效的研究基因功能的新方法。但是在RNAi发现的早期,由于应用的双链RNA分子的长度大于

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RNA干扰及其在动物基因功能研究中的应用　苏光华,等30bp,在哺乳动物细胞内会诱导干扰素的产生,从而导致细胞死亡,在哺乳动物细胞的研究中受到了[14]。2001年,Elbashir[15]在体外细胞培养中证实了21bp的RNA双链分子在哺乳动物细胞中不会导致干扰素的产生。利用siRNAs可以绕过抗病毒干扰素反应,在体外培养的哺乳动物细胞中达到基因敲除的效果。对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。此外可用RNAi技术阻断胚胎干细胞中某些基因的表达,研究它们在增殖和分化过程中是否起作用。国内外已报道利用鼠胚胎干细胞研究基因对发育及其它方面的功能[13]。在人类基因功能的研究方面,Huang等利用RNAi研究网格基因蛋白介导EG F受体的细胞吞饮机制,他运用了RNAi技术抑制了Hela细胞中13种内吞蛋白的表达[16],这对于应用核酸酶技术和反义RNA技术是很难实现的。目前应用RNAi技术对基因功能的研究已经成为基因功能研究的重要手段之一。在人类基因组完全测序后,面对大量功能不明的基因,需要开发可以大规模、高通量、自动化的研究基因功能的新方法。由于RNAi能高效特异地阻断基因的表达,并且相对简便,因而RNAi有可能成为功能基因组研究中比较便利高效的策略。可以预见RNAi技术将对功能基因组学的研究产生巨大推动。

212　RNAi在抗病毒研究中的应用　由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制,HI V病毒感染是我们亟待解决的问题,将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事1目前利用RNAi抗病毒感染的研究已经展开,主要集中在HI V病毒和脊髓灰质炎病毒,并取得了令人鼓舞的结果[17]。针对HI V 病毒研究有Jacque等[18]设计的抑制HI V-1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA,Lee 等[19]针对rev转录设计的siRNA及Novina等[20]针对HI V病毒gag基因设计的siRNA,其基本策略都是选择HI V病毒或宿主细胞基因为靶点1然而, RNAi治疗HI V,应用于临床,有几个重要问题必须解决[21]:(1)作用靶点的选择1siRNA对序列要求非常严格,1个碱基的错配,将大大降低siRNA基因表达抑制作用1如果HI V逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核苷酸每个复制循环),就可能迅速导致所谓siRNA逃逸突变的出现感染个体中HI V序列的多样性,为siRNA的设计和合成增加了难度。

(2)如何有效导入siRNA1DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果,但在原代细胞中效果较差。(3)增强siRNA在细胞中的稳定性1为了防止细胞内RNA 酶对siRNA的降解,可以用DNA质粒和病毒载体将siRNA以发夹(hairpins)的形式导入细胞内1由于S ARS病毒侵入人体后,其中的RNA分子利用人细胞的合成系统进行复制病毒RNA的复制与S、M、N和HE等蛋白的合成,最终装配成新病毒排到细胞外,再侵蚀其他细胞。所以利用siRNA阻断相关蛋白的表达,从而达到治疗S ARS的目的是可行的。RNAi研究的一般技术路线是:确定在代谢、信号传导等途径中处于中枢地位的分子→根据相对应的核酸序列设计出siRNA的序列→获得siRNA产物→转染细胞→分析RNAi的效果。

213　RNAi在转基因动物中的应用　RNAi技术的一个重要应用就是制备RNAi转基因动物模型,在整体水平缄默靶基因的表达。用RNAi技术在整体水平缄默基因的表达与基因敲除相比有几个优点。首先,如前所述,RNAi理论上可以在任何动物模型上进行。另外,通过制备针对靶基因mRNA不同区段的siRNA转基因动物,有可能获得对靶基因不同程度的缄默效果,从而可以模拟数量遗传性状[22]。这一点也是基因敲除技术所不具备的。虽然理论上RNAi可以在任何动物模型上进行,但目前报告的RNAi转基因动物还仅限于转基因小鼠。T iscornia 等[23]在G FP转基因小鼠的基础上再进行siG FP转基因的实验。他们首先用常规方法使野生型供体雌小鼠超排卵,并与G FP转基因雄小鼠交配。得到的双原核期受精卵细胞用构建有siG FP的慢病毒感染。感染后48h将胚胎植回假孕受体小鼠子宫内。得到的F0代小鼠基因组中既有G FP基因,又整合有慢病毒基因组,表现为绿色荧光表达明显减弱。在一只通过PCR技术既检测到G FP基因又检测到siG FP基因的F1代小鼠中,其全身绿色荧光的表达同样被显著的缄默。类似地,okabe研究小组[24]在G FP转基因小鼠和G FP转基因大鼠的基础上,进一步用传统的受精卵原核显微注射siG FP的方法进行RNAi转基因的研究。F0代新生小鼠的绿色荧光表达显著减少,F0代大鼠胚胎的绿色荧光几乎检测不出。同样,他们也观察到了G FP表达特异性缄默传递至F1代小鼠的现象。

3　结束语

RNA干扰的研究成为近几年的热点,很快从

28怀化医专学报,2006,5(2)线虫的研究拓展到各种生物的研究,同时也成为基因治疗的极具潜力的工具。目前RNA干扰在生物化学、分子生物学、制药、医学等各个领域得到了广泛的应用,随着技术的成熟,相信在不久的将来这一技术会在生命科学的领域中大有作为,成为遗传学与分子生物学研究的有力工具。

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[责任编辑:谭得圣]

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