野生来源TW近交系小鼠的遗传监测

中国比较医学杂志

CHINESE JOURNA L OF COMPARATIVE ME DICINE August ,2004

V ol.14　N o.4

研究报告

野生来源TW 近交系小鼠的遗传监测

管　彤1

,王凤山1

,刘双环2

,于国德1

,穆瑞东

1

(11天津市卫生防病中心,天津　300011;21中国药品生物制品检定所)

　　【摘要】　目的　对中国特有野生来源的T W (T ianjin Wild )小鼠近交系进行遗传质量检测。方法　按照国标

G B ΠT 149271122001、G B ΠT 149271222001及WH O (国际实验动物科学理事会)遗传检测操作规程,对T W 近交系小鼠进

行Akp1等25个遗传生化标记基因纯合度测定,进行组织相容性基因纯合度的测定。结果　对T W 近交系小鼠进行Akp1等25个遗传生化标记基因的测定,所检基因均为纯合体。同时,在所检的25个遗传位点中,发现有8个罕见生化标记基因多态性位点;检测的组织相容性基因为纯合。结论　按照国家标准,野生来源的T W 小鼠近交系遗传纯合度已达国标,成为高度纯合的近交实验小鼠品系,并可望成为具有标准基因库(型)的近交小鼠品系。

【关键词】　小鼠,近交,T W ;遗传监测;生化标记基因;皮肤移植

【中图分类号】Q331+

18　　【文献标识码】A 　　【文章编号】167127856(2004)0420205203

G enetic Monitoring to Wild Derived TW I nbreeding Mouse

G UAN T ong 1

,W ANG Feng 2shan 1

,LI U Shuang 2huan 2

,Y U G uo 2de 1

,M U Rui 2dong

1

(1.T ianjin Center for Disease C ontrol and Prevention ,T ianjin 300011,China ;2.National Institute for the C ontrol of Pharmaceutical and Biological Products

)【Abstract 】　Objective 　T o m onitor the genetic quality of the new wild derived inbred strain of mice trapped originally in

China.Methods 　According to national standard ,G B ΠT 1492711-2001,G B ΠT 1492712-2001and the procedure from Interna 2tional Laboratory Animal C ommission ,25biochemical markers for genetic m onitoring of T W (T ianjin Wild )inbred strain were per 2formed ,and skin grafting test was als o carried out.R esults 　Measurement of 25biochemical markers gene loci was performed by electrophoresis and the results revealed that all observed gene loci were hom ogenous without any polym orphism and mutation.O f the 25loci observed ,8were found to show the rare subtypes.The skin grafting test showed that no dropping graft was found during 100days after transplantion ,implying the T W was of is ohistogenicity.Conclusion 　The T W inbred strain m ouse is high hom oge 2nous in the genetic characteristics and it is possible for the T W inbred strain to be a standard m odel of genetic m onitoring of bio 2chemical markers.

【K ey w ords 】　Mice ,inbred ,T W ;G enetic m onitoring ;Biochemical markers ;Skin grafting

[基金项目]天津市自然科学重点基金项目(项目号:003803511)[作者简介]管彤(1968-),女,助理研究员,从事实验发育生物

学及卫生毒理学研究。

　　1993年我们由中国内蒙古捕获了T W (T ianjin

Wild )小鼠并对其进行遗传学特征调查及野生小鼠

近交化工作1

。期望通过严格的同胎雌雄(兄妹)交配,近交驯化至20代,使其遗传近交系数达到

9816%以上,培育出由野生小鼠来源的实验近交系

小鼠品系。经过12年的精心培育,已近交培育T W 小鼠至F22代。为了观察T W 近交系小鼠的遗传质量,按照国标对T W 小鼠21～22代的小鼠进行了生化标记基因位点检测和皮肤移植试验,以便确认T W 小鼠的遗传相对稳定性与遗传纯合度,确立野生来源的T W 近交小鼠品系。

1.1　实验动物

用于生化标记基因监测的被检测动物为近交化至21～22代的雄性小鼠,由10～14周龄的群体中随机取样,共计16只。用作标准对照的DBAΠ2、C BAΠN、C57BLΠ6等近交系小鼠来自中国药品生物制品检定所(合格证号:SCXK1120020010)。用于皮肤移植试验的动物为近交化至21～22代的雌性小鼠,由10～14周龄的群体中随机取样,共计10只。

1.2　生化标记基因监测

11211　电泳样品的制备:随机选择雄性T W小鼠8只,血清和肾组织均浆及所用缓冲液的制备均按文献2-4的方法进行。(1)血浆及溶血上清:从小鼠眼眶取全血,放入预先放有抗凝剂的试管中,4000 rΠmin离心5min,上清为血浆。去除血浆的血球中加入P BS洗涤,4000rΠmin离心10min,防腐洗涤3次,加入蒸溜水,体积分数为25%,振荡1min,低温冰箱冻存,过夜,次日融冻,使血球溶解,16000rΠmin 离心20min,吸取溶血上清液,分装冻存备用。(2)肾均浆:取小鼠肾脏,剥除肾包膜,加4倍体积蒸溜水捣碎,低温冰箱内过夜,次日融冻后离心(4℃, 16000rΠmin离心30min)。吸取上清液分装冻存备用。

11212　染(显)色:电泳完毕后,如染色,直接在丽春红2S染色液中浸染3～5min,用5%醋酸液脱色固定后,水冲洗风干。酶位点显色液应用中国药品生物制品检定所生产的实验动物遗传生化位点检测专用试剂盒,按操作说明进行。

11213　电泳条件与方法:按照国标及国际实验动物科学理事会遗传检测操作规程进行,详见表1。

表1　T W小鼠生化标记基因蛋白质电泳条件

T ab.1　The electrophoresis conditions of biochemical markers for T W inbreeding mice

标记Loci

支持物

M embrane

缓冲液

Bu ffer

pH

标本

Sam ple

泳动方向

Direction

电压

(V)

时间

(min)

染(显)色

S tain

Akp213T ris2Citrate8121-→+20040△Amy213T ris2Citrate8121-→+20030△Apk213T ris2Citrate8131-→+20030△Car223NaC2H3O22E DT A5142+→-20040# Ce223T ris2Citrate7161-→+20030△Es213Phosphate7103-→+14030△Es223Phosphate7101-→+14030△Es233T ris2G lycine8191-→+28030△Es2103T ris2G lycine8191-→+30025△Es2113T ris2E DT A9111-→+20030△

G dc213T ris2硼酸41-→+20030△

G pd213T ris2G lycine8191+→-20090△

G pi213T ris2G lycine8152-→+20030△

G us213E DT A2NaAc41-→+20030△

Hbb3T ris2G lycine8152-→+20030# Idh213T ris2Citrate7161-→+20030△Ldh213T ris2G lycine8151-→+20030△M od213T ris2Citrate7161-→+20030△Np213T ris2G lycine9112-→+20030△Pgm213T ris2G lycine8151-→+20035△Pgm223T ris2G lycine8141-→+20030△Sep213T ris2G lycine8142-→+20040# T am213T ris2G lycine8135+→-20015△T rf3T ris2G lycine8153-→+20025#

注:标本1:肾匀浆;标本2:溶血上清;标本3:血清;标本4:肝匀浆;标本5:颌下腺匀浆;3:醋纤膜;△:试剂盒;#:丽春红2S

N ote:1:hom ogenate of kidney;2:hem olytic supernate;3:serum;4:hem ogenate of liver;5:hom ogenate of submaxillary gland.1.3　皮肤移植试验

从21～22代的T W小鼠的维持群中,随机选择10～14周龄的健康雌性小鼠10只,3或4只为一组,进行交互皮肤移植实验5。具体步骤为:(1)麻醉动物:腹腔注射0102mlΠ(g.bw)的112%戊巴比妥钠麻醉动物;(2)皮片制备:除去小鼠背部手术区的毛,消毒,用手术镊子夹起事先消毒的皮肤,用眼科弯型剪刀剪下直径约018～110cm大小的圆形皮片;(3)植皮:去除皮片上多余的脂肪,将左侧皮片反向原位植入,右侧皮片反向组内交互植入,用凡士林纱布覆盖,胶布固定;(4)结果判定:术后5～7d拆开敷料,观察100d,如左侧原位移植皮片和右侧交互移植皮片均不被排斥,视为成活。

2　结果

(1)按G BΠT1492711-2001及WH O(国际实验动物科学理事会)遗传检测操作规程,对T W近交系小鼠进行Akp1等25个遗传生化标记基因的测定,未发现杂合体。所检遗传生化标记基因均为纯合体(表2)。同时,在所检测的25个遗传位点中,与国际近交系小鼠遗传特征比较,发现了8个非常见生化标记基因多态性位点(表3)。

(2)按G BΠT1492712-2001遗传检测操作规程,对T W近交系小鼠进行组织相容性基因的检测,未发现排斥反应,遗传质量合格。

表2　T W小鼠生化标记基因检测结果

T ab.2　Biochemical markers of inbreeding T W mice

编号N o.位点

Loci

基因型

G enotype

编号

N o.

位点

Loci

基因型

G enotype

1Akp21b14G us21b 2Amy21b15Hbb p 3Apk a16Idh21b 4Car22a17Ldh21a 5Ce22a18M od21a 6Es21a19Np21b 7Es22c20Pep23b 8Es23b21Pgm21b 9Es210c22Pgm22b 10Es211a23Sep21b 11G dc21b24T am21a 12G pd21c25T rf b 13G pi21a

表3　T W小鼠非常见多态性生化标记基因位点

T ab.3　Rare polym orphism of biochemical markers

in inbreeding T W mice

序号

N o.

位点

Loci

基因型G enotype

TW DBAΠ2C BAΠN C57BLΠ6BA LBΠc C3H 11Amy21b a a a a a

21Es22c b b b b b

31Es23b c c a a c

41Es210c b b a a b

51G pd21c b b a b b

61Hbb p d d s d d

71Np21b a a a a a

81pgm22b a a a a a

3　讨论

我们对已近交化至F22代的T W小鼠进行遗传质量(遗传纯合度)鉴定,以便在国际上确立该品系。从完成的遗传生化标记基因纯合度来看,按国内最高标准检测的25个基因位点为全部纯合,其中超出国标的12个遗传生化位点参照WT O(国际实验动物科学理事会)遗传检测操作规程完成。检测结果发现该品系小鼠在Amy21等8个基因位点上具有非常见的亚型多态性,在检测的共计25个遗传生化位点中,有近三分之一的位点出现亚型多态性,使得T W近交系小鼠成为中国产野生来源的极好的动物标准型,或叫近交系小鼠标准基因库(型)。有关T W近交系小鼠遗传生化位点亚型多态性形成的分子机制,有待于进一步探讨。另外,考虑到对中国产野生来源的近交系小鼠的检测,尚属首次,检测结果,在25个遗传生化位点上全部纯合,在Amy21等8个基因位点上的亚型多态性完全一致,进而从遗传生化位点水平上确立了T W小鼠的遗传纯合度。

其皮肤移植检测中,以自身皮瓣作为检测技术质控,观察异体移植皮肤至100d,未发现排斥反应,说明H22抗原复合体等组织相容性基因已经纯合。参考文献:

1]　王凤山,管彤,郝连义,等.中国三北地区部分野生小鼠形态分类学分析J.实验动物科学与管理,2000,17:1-51

2]　国家标准S G BΠT1492712-20011实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法.

3]　章根木,姚甘火.中国昆明小鼠(K M鼠)遗传背景资料调查J.中国实验动物学杂志,1997,7(4):246-2511

4]　李华,王太一,史晓平.生化标记基因法对近交系小鼠扩大生产群的遗传检测J.中国实验动物学杂志,1996,6(1):43

-461

5]　国家标准S G BΠT1492711-20011实验动物近交系小鼠、大鼠皮肤移植法.

〔收稿日期〕2003211219