水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定

王斐斐 陈碧环 朱艺静 陈彬汾

一、实验目的

1.学习水样的采取方法、了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。

2.学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。

3.学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。

二、实验原理

水是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物以及垃圾等。水中微生物种类及数量可说明水源被有机物污染的程度水和饮料的微生物学检查，常检测其细菌总数和大肠杆菌菌群数，判断水和饮料被污染的程度。我国现行的生活饮用水的卫生标准为1 mL水中细菌总数不超过100个；每1 L水中大肠菌群数不超过3个，超过此数，表示水源可能受粪便等污染严重，水中可能有病原菌存在。

所谓细菌总数是指1mL或1g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。本实验所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。

所谓大肠菌群，是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。本实验采用滤膜法。滤膜法是采用滤膜过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，其孔径约 0.45　μm。

滤膜法示意图

新知识点：EMB培养基（伊红美蓝），伊红和美蓝作为指示剂，在乳糖发酵产酸时两者结合成复合物，使大肠菌群产生核心的、有金属光泽的深紫色菌落。

三、实验器材

1.培养基

乳糖发酵管、伊红美蓝培养基（EMB培养基）、牛肉膏蛋白胨培养基

2.溶液和试剂

自来水、牛奶、革兰氏染色液、无菌水等

3.仪器和其他用品

显微镜、载玻片、灭菌三角瓶、灭菌带塞空瓶、灭菌移液管、灭菌试管、德汉氏小管、灭菌培养皿、滤膜（孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种）、真空泵、夹钳、镊子、烧杯、移液。

4、操作步骤

1.培养基的制作

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 

成分:

   牛肉膏3 g，蛋白胨l0 g，NaCl 5 g，琼脂15-20 g, 水1000 mL，pH 7.4～7.6 

 过程(详见实验一):

1. 称量2. 加热溶解3. 调pH  4. 过滤5. 分装6. 加棉塞7. 包扎8. 灭菌

（二） 乳糖发酵管 

成分：

蛋白胨 20g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL、蒸馏水1000mL、pH7.4    

制法：

将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。 

（三）伊红美蓝培养基（EMB培养基）

成分：

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2％伊红（曙红）水溶液 20mL，5％美蓝（亚甲蓝）水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

制法：

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正PH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

二．水样的采集：

（1）自来水：先将自来水龙头用火焰灼烧3分钟灭菌，再开放水龙头使水流五分钟后，在火焰旁打开灭菌三角烧瓶瓶塞，接取水样以备分析。

（2）牛奶：在无菌操作下，将已封闭的饮料打开，在火焰旁用三角瓶取样，并进行稀释（10倍，100倍，1000倍），并迅速进行分析。

三．水样中细菌总数的检测

1.自来水中细菌总量的检测

a.用移液吸取1ml水样，注入牛肉膏蛋白胨培养基中，并进行涂布平板（做两个以上）。

b.另取一牛肉膏蛋白胨培养基，加无菌水，做空白对照。

c.培养基凝固后，倒置于37度恒温培养箱，培养24小时，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数，即为1ml水样的细菌总数。

2.牛奶中细菌总量的检测

与测自来水的细菌总数的方法一致。（每个稀释倍数的样液均要涂布）

四.大肠菌群检测（滤膜法）

1.滤膜清洗:将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中,煮沸三次,每次15min,前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。

2.滤器灭菌:用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用121℃高压灭菌20min。

3.过滤水样:用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL样液(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。

4.培养:样液滤完好，再抽气5秒，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子取下滤膜,将无菌的一面贴在伊红美蓝平板培养基上，滤膜应与培养基完全贴紧，滤膜与培养基之间不得有气泡,于37℃培养箱倒置培养24h。

5.镜检:挑取紫黑色或紫红色、有金属光泽的菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。

6.乳糖发酵:凡镜检为革兰氏染色阴性、无芽孢的杆菌,每个菌落接种一支乳糖发酵管,37℃培养24h,产酸、产气者为大肠菌群阳性。未产酸、产气者继续培养至48h,仍未产酸、产气者为大肠菌群阴性。

五、实验结果

1.细菌总数计算：

A:菌落的平均数；n：稀释倍数；V：体积

2.大肠菌群

1L水样中的总大肠菌群=滤膜上的大肠菌群菌落数*10（1L与所取的样液体积之比）