比浊法测定抗生素

生药1021   戴济锋

一、实验目的

1.掌握比浊法测定的原理及方法；

2.学会标准曲线的制作和培养基的制备。

二、实验原理

细菌接种于澄清的营养丰富的液体培养基中，在一定的温度下培养一段时间，变浑浊，其浑浊程度与细菌生长的浊度与细菌数的增加，细菌群体质量的增加和细菌细胞容积的增加之间，存在直接关系，可用朗伯-比尔定律形式表示。

   NEab / 2.3

 ：入射光的强度    

I：透射光的强度

 ：细菌的质量     

E：细菌颗粒的吸收系数

 ：细菌颗粒的光学有效面积

 ：细菌悬液的厚度

在抗生素存在时，理论的剂量反应方程为：

 Nt = N0exp[K0 + f（V）Km - KaC] t

 Nt：培养t时间后细菌的质量

 ：开始培养时细菌的质量

 ：在无抗生素存在时，细菌繁殖代数的速度常数

 ：抗生素浓度，Ka为其抑制常数，Km为溶剂效应

 （v）：试管内样品体积的函数

实际上，上面的N0、K0、f（v）、Km、Ka和t不能确知，但在各试管内均相同为一常数，因此，可简化为

       log N = G + BC

G：直线的截距        

B：直线的斜率

 ：抗生素的浓度

 如1og N用细菌悬液的吸收度表示，则

    logA = E + FC

因此，在剂量反应曲线的直线范围内，可设计微生物浊度法测定抗生素的含量。

三、实验试剂、材料及设备

1.材料：金黄色葡萄球菌

2.试剂：营养肉汤培养基（蛋白胨10g，琼脂15~20g，氯化钠5g，肉浸液1000ml,;除琼脂为，混合上述成分，调节pH使比最终的pH略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后虑过，调节pH使灭菌后为7.2~7.4，分装，在121℃灭菌30分钟，趁热释放使凝固成斜面。）、无菌水、0.9%灭菌氯化钠溶液、甲醛溶液、抗生素标准品、抗生素供试品，灭菌缓冲液。

3.设备：立式整齐灭菌锅、培养箱、检测仪、试管、烧杯、天平、电炉等。

四、实验步骤

(一)、准备工作

1.试管的准备

 （1）．新试管

  经洗净后，用160℃干烤1～3小时灭菌，注意保持清洁，避免被抗生素、抑菌物质、毛点、纤维污染。

 （2）．使用过的试管

  经灭菌后，将培养基倒出，先用清水冲洗，必要时用硫酸-重铬酸钾洗液浸泡、清水冲洗，然后再用纯化水冲洗干净后，晾干，再经160℃干烤1～3小时灭菌，备用。 

2.其他玻璃器具的准备

   其他玻璃器具如称量瓶、容量瓶、滴定管等，先用清水冲洗，再用清洁液或洗液浸泡1-2h，然后用水、纯化水冲洗干净，淋干，置于相应托架，室温干燥。

3.培养基的制备

  按照药典附录Ⅺ中培养基Ⅲ的规定进行配置，并按要求调节pH值，使灭菌后的pH值在7.0~7.2之间，根据我们的实验Ⅲ号培养基灭菌后要比灭菌前的pH值下降0.1-0.2个单位。 所以在灭菌前调节pH值时要稍高于规定pH值。

4.试验用菌悬液的制备 （以金葡菌[Stap-hylococcus aureus]为例）

  取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]的营养琼脂斜面培养物，接种至营养琼脂斜面上，在35-37℃培养20-22小时，临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下制成悬液，备用。 

5.含菌培养基的制备 

  临用前，取规定的试验菌悬液适量（35-37℃培养3-4小时后测定的吸光度值在0.3-0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。

  已接种试验菌的液体培养基应立即使用。

6.标准品溶液的制备

  标准品的使用和保存应照标准品说明书的规定。临用时照下页表1中的规定进行稀释。

7.供试品溶液的制备

  精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照下页表1中的规定稀释至与标准品相当的浓度。 

表1抗生素微生物检定浊度法试验设计表

抗生素

 除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各种品种项下规定的剂量反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1：1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。 

在各试管内精密加入各浓度的含菌液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml，（USP28、EP5及JPⅩⅣ中加入顺序为先加入标准品或供试品溶液，再加入含菌培养基）立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4h），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1→3）0.5ml以终止微生物生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。

同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照CP2005版规定的标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。 

(三)、抗生素稀释 

 取相应抗生素，照药典规定制备1000u/ml溶液，根据预实验中确定的浓度用pH 7.8的磷酸盐缓冲液，同步稀释标准品和样品，每步稀释时标准品和样品最好用同一支刻度吸管或移液管，以消除吸管间的系统误差。 

(四)、加样

 精密吸取稀释好的抗生素溶液1.00ml ， 按拉丁方阵排列方法或随机排列顺序加入各个试管中，加样时需要按从低浓度到高浓度的顺序，使用同一支刻度吸管吸取溶液，以减小由于各浓度溶液所使用刻度吸管的不同引起的误差。

(五)、加含菌培养基

  按照预实验中所得的结果，吸取实验用适量于培养基中，摇匀，用灭菌刻度吸管吸取9.0ml，分装于各个试管中。

(六)、培养

  将加好抗生素溶液及带菌培养基的试管放在37±0.1℃下培养3-4小时。

(七)、检测

  如能保证在20秒内完成全部2批样品(40支比色皿)测量过程，则不需要灭菌，否则需需将比色皿或大试管取出，立即加入（1→3）甲醛溶液0.50ml，摇匀，再进行测量，以保证测量结果的准确性。 

五、抗生素微生物检定法标准曲线法的计算

1.标准曲线的计算 

标准品的各浓度lg值及相对应的吸光度

按下图公式（1）和（2）分别计算标准曲线的直线回归系数（即斜率）b和截距a，从而得到相应标准曲线的直线回归方程（3）：

回归系数：b=    ⑴

截距：a=                        ⑵

直线回归方程：Y=bX+a                     ⑶ 

式中   为标准品的实际吸光度；

Y为估计吸光度[由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到]；

       为标准品实际吸光度的均值；

       为抗生素标准品实际浓度lg值；

       为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。

抗生素浓度lg值的计算 当回归系数具有显著意义时，测得供试品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程（3），按方程（4）计算抗生素的浓度lg值。

供试品含量的计算：将计算得到的抗生素浓度（将1g值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。