双荧光素酶检测

1.按照目的基因3’-UTR段的碱基序列设计PCR引物；

2.以目的细胞基因组DNA为模板行PCR扩增；

3.PCR反应完后取2ul产物进行1%琼脂糖电泳分析，按照凝胶纯化试剂盒说明书进行纯化产物；

4.对上述PCR产物和载体进行双酶切；（找到酶切位点）

5.采用DNA连接酶将双荧光素酶报告载体与目的基因3’ -UTR片段相连。（反应体系是PCR产物与荧光素酶报告载体以3:1比例混合）

细胞转染：

具体转染方法根据购买转染试剂盒说明书进行。

1.培养目的细胞，传代；

2.将目的细胞以每孔4×104个接种于96孔板中，第二天按实验分组；

3.将25ul不含血清的培养基与重组质粒和对照抑制剂加入EP管混合5分钟；同法将脂质体和25ul不含血清的培养基混合5分钟；

4.然后，将每组的质粒混合液与转染试剂混合液加入到 EP管中，混合25分钟；

5.加入96孔培养板中，混合均匀后，放入到培养箱中培养6h小时后，换用含 10% 血清的培养基；

6.转染24时后收集细胞，检测荧光素酶活性。

荧光素酶活性测定：

按照购买的双荧光素酶检测试剂盒提供的操作方法检测在目的细胞中microRNA X，RANKL-3’UTR荧光素酶活性的改变。

1.用只含PBS的孔将荧光检测仪校准；

2.吸去96孔板中的培养基，用PBS洗涤细胞；

3.向每孔加入100ul的工作液1，避光均匀摇动10分钟；

4.用荧光检测仪检测。