洁净区环境测试操作规程

颁发部门：质量部

分发部门：生产部、设备部、质量部、采购部、仓储部、财务部

一、目的：建立一个空气洁净度监测标准操作规程，规范空气洁净度监测操作程序，保证细胞生产洁净车间的空气洁净度符合GMP 要求。

二、范围：适用细胞生产洁净车间的空气洁净度的监控。

三、职责/依据：质量部负责该标准操作规程的制订，并监督制度的执行；质量保证部和质量控制部门负责该标准操作规程的实施；质量保证部门对进行监督与检查。

四、程序/内容：

1  概述

1.1洁净厂房是指根据需要对空气的尘粒（包括微生物）、风速、温湿度及压力等进行控制的密闭环境，其建筑结构、装备及其使用均具有减少该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能，并以其空气洁净度等级符合《药品生产质量管理规范》的要求。

1.2  洁净厂房分为：D级、C级，B级、A级。本公司细胞生产洁净区为D级、C级和局部A级。

2  沉降菌测试

2.1  方法概述

本测试方法利用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经48 小时以上培养，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。

2.2  所用设备及仪器

高压灭菌锅：使用时严格按照操作规程使用

恒温培养箱：定期对培养箱温度进行检定

2.3  培养皿：一般采用ф90mm×15mm玻璃培养皿。

2.4  培养基：普通营养琼脂培养基

将培养基加热熔化，冷却至约45℃，在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养皿放入30~35℃恒温培养箱中培养48 小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养皿应在2~8℃的环境中存放。

2.5  测试步骤

1）采样

①将已制备好的培养皿放置在预先确定的取样点，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。

② 静态测试时，培养皿暴露时间为30分钟以上；动态测试时，培养皿暴露时间为4小时，单个沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多个沉降碟连续进行监测并累积计数。

③全部采样结束后，将培养皿盖上盖子，倒置放置。

2）培养

①全部采样结束，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。

②在 30~35℃培养，时间不少于72h。

③每批培养基应有对照试验，检查培养基本身是否污染，可每批选定3 只培养皿作对照培养。

3）菌落计数

①用肉眼直接计数。

②若培养皿上有2 个或2 个以上菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2 个以上的菌落计数。

2.6 注意事项

1）测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、准确性。

2）采取一切措施防止人为对样本的污染。

3）对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。

4）由于细菌种类繁多、差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。

5）采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。

2.7 测试规则

1）测试状态

①沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，压差必须控制在规定值内。

②沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。

③测试状态有静态和动态两种，状态的选择必须符合生产的要求，并在报告及记录中注明测试状态。

2）测试人员

①测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。

②静态测试时，室内测试人员不得多于2 个人。

3）测试时间

①静态测试时，洁净厂房的空气净化调节系统的风机启动30分钟后开始测试。

②动态测试，在生产人员处于正常生产状态下进行的测试。

③对单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于10 分钟后开始。

④对非单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于30 分钟开始。

4）沉降菌计数

①采样点数目及布置：采样点布置参考图1，工作区测试点位置离地0.8~1.5m 左右（略高于工作面）。

②最少采样点数目，沉降菌的最少采样点数可按表1确定。

③可在关键设点或关键工作活动范围处增加测点，采样点的布置应力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，某局部区域过于稀疏。

图1 沉降菌采样点数目及布置图

表1最低限度采样点数

2.8 记录：测试报告中应记录房间测试状态及测试数据。

2.9 结果计算

1）用计数方法提出各个培养皿的菌落数。

2）平均菌落数的计算见下式：

平均菌落数 m =   

式中： m 为平均菌落数；

m1 为1 号培养血菌落数；

m2为2 号培养皿菌落数；

mn号培养皿菌落数；

n 为培养皿总数。

 3）动态监测时，如果培养皿暴露时间小于4小时，最终的菌落计数（cfu／4h）应为：

                           最终菌落计数M=m/实际暴露时间×4

式中：   m 为平均菌落数；

M为最终累计4小时菌落计数。

2.10 结果评定：用平均菌落数判断洁净室的空气中的微生物。

1）洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准，见表3。

表3评定标准

3. 尘埃粒子测试

3.1 概述：洁净区悬浮粒子监测采用计数浓度法，即通过测定洁净区环境内单位体积空气中含某粒径的悬浮粒子数，来评定洁净室（或洁净区）的悬浮粒子洁净度等级。

3.2 仪器：Metone-3400型微尘粒子计数器。

3.3 监测原理：空气中悬浮粒子在光的照射下产生光散射现象，散射光的强度与粒子的体积成正比。

3.4 Metone-3400型微尘粒子计数器使用要点。

1）使用仪器时应严格按照《Metone-3400型微尘粒子计数器标准操作规程》进行操作。

2）仪器开机预热至稳定后，方可按说明书的规定对仪器进行设置。

3）采样管口置采样点采样时，在确认计数稳定后方可开始连续读数。

4）采样管必须干净，严禁渗漏。

5）采样管的长度应根据仪器的允许长度。除另有规定外，长度不得大于1.5m。

6）计数器采样口和仪器工作位置应处在同一气压和温度下，以免产生测量误差。

7）必须按照仪器的检定周期，定期对仪器作检定，以保证测试数据的可靠性。

3.5 测试规则

1）测试条件

①温度和湿度：洁净室（区）的温度和相对温度应与其生产及工艺要求相适应（温度控制在18~26℃，相对湿度控制在45~65%之间为宜）。

②压差：有洁净级别要求的洁净室（区）相对非洁净室（区）的压差应大于10Pa，空气洁净度不同的洁净室（区）之间的压差应大于10Pa，空气洁净度等级相同的区域，产尘量大的操作室应保持相对负压（≤-5Pa）。

2）测试状态

①静态测试：洁净室（区）净化空气调节系统已处于正常运行状态，工艺设备已安装，洁净室（区）内没有生产人员的情况下进行测试，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。

②动态测试：洁净室（区）已处于正常生产状态下进行测试。

③测试报告中应标明测试时所采用的状态。

3）测试时间

①对单向流测试应在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min 后开始。

②对非单向流测试应在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min 后开始。

4）悬浮粒子计数

①采样点数目及其布置

A、最少采样点数目：悬浮粒子洁净度测试的最少采样点数目可以按照表1确定。

B、采样点的布置

a、采样点一般在离地面0.8～1.5m 高度的水平面上均匀布置。

B、采样点的布置还可根据需要在生产及工艺关键操作区增加采样点。

②采样点的限定：对于任何洁净室面积较小或局部空气净化区域，采样点的数目不得少于2 个，总采样次数不得少于5 次。每个采样点的采样次数可以多于1 次，且不同采样点的采样次数可以不同。一般情况下，测点的位置如下图2所示：

注：    为采样点。

③采样量：不同洁净级别每点·最小的采样量，见表5。

表5不同洁净级别每点最小采样量

A、在确认洁净室（区）压差达到要求后，方可进行采样。

B、对于单向流，计数器采样管口朝向应正对气流方向，对于非单向流，采样管口垂直向上。

C、当采样点与设备重叠时，可取消该采样点（在保证最少采样点数目的前提下），或将采样点设在设备的上风侧。

D、布置采样点时，应避开回风口。

E、采样时测试人员应站在采样口的下风侧。

3.6 结果计算：悬浮粒子浓度的采样数据应按下述步骤统计计算

1）以测试打印的数据为依据进行计算。

2）打印数据上应包括的内容：采样点（A）、采样次数（L）、年月日、测试时间、测量周期（F）、粒径（含0.5µm和5µm）及测试数据、每M3空气中的粒子数、UCL 值、级别。

3）每点测试三次，将三次的测试数据（0.5µm、5µm）平均，即为采样点的平均粒子浓度。

式中：A：某一采样点的平均粒子浓度（粒∕m3）

N：某一采样点的采样次数

Bi：某一采样点的粒子浓度（i=1，2，3…N）粒∕m3

A1+A2+…+AL

L

4）平均值的均值

M=

式中：M：平均值的均值，即洁净室（区）的平均粒子浓度，粒∕m3。

                           Ai：某一采样点的平均粒子浓度（i=1，2，3…L），粒∕m3。

                           L：某一洁净室（区）的总采样点数，个。

         5）标准误差

式中：SE：平均值均值的标准误差，粒∕m3。

6）置信上限

UCL=M+t×SE

式中：UCL：平均值均值的95%置信上限，粒∕m3；

                 t： 95%置信上限的t 分布系数，见表6。

表 6 t 分布系数表

①A级洁净度打印取值范围：采样量1000升，采样时间10 分钟，取三次打印值按以上公式进行计算。

②C级洁净度打印取值范围：粒子的采样量100 升，采样时间1 分钟，取三次打印值按以上公式进行计算。

③D级洁净度打印取值范围：粒子的采样量100 升，采样时间1 分钟，取三次打印值按 以上公式进行计算。

3.7 结果评定：判断悬浮粒子洁净度级别应依据下述两个条件：

1）每个采样点的平均粒子浓度必须低于或等于洁净级别规定的级别界限，即A≤级别界限。

2）全部采样点的粒子浓度平均值均值的95%置信度必须低于或等于规定的级别界限，即UCL≤级别界限。

3.8 悬浮粒子级别界限(见表7)：

表7悬浮粒子级别界限

4 浮游菌测试

4.1方法概述

本方法采用计数浓度法，即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基，经48小时后，在适宜的生长条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，从而判定洁净环境内单位体积空气中的活微生物数，以此来评定洁净室（区）的洁净度。

4.2 所用的仪器和设备

1）高压消毒锅：使用时应严格按照操作规程进行。

2）恒温培养箱：必须定期对培养箱的温度计进行检定。

3）浮游菌采样器：MAS 100 NT 空气浮游菌采样器。

4.3空气采样量：

根据需要选定，已知采样器的流量（L/min），设定采样时间（min），两者相乘即采样量（L）。

4.4  注意事项

1）采样口必须用便于消毒及化学性能稳定的材料制造。

4.5  测试步骤

1）测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。

2）采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒。

3）全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在30～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。

4）每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。

4.6测试规则

1）测试状态

①浮游菌测试前，被测试洁净室（或洁净区）温、湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。

②浮游菌测试前，被测试洁净室（或洁净区）已经过消毒。

③测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。

2）测试人员

①测试人员必须穿戴符合环境级别的工作服。

②静态测试时，室内测试人员不得多于2人。

3）测试时间

① 对单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。

② 对非单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。

4）浮游菌浓度计算

①采样点数量及其布置

A、最少采样点数目：悬浮粒子洁净度测试的最少采样点数目可以按照表1确定。

B、采样点的位置：采样点位置可以同悬浮粒子测试点。

a、工作区测点位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。

b、可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。

②最小采样量：采样量根据日常检测及环境证实，每次最小采样量见表9。

表9浮游菌测试最少采样量

④采样注意事项

A、对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方向；对于非单向流，采样管口向上。

B、布置采样点时，至少应离开尘粒较集中的回风口1m以上。

C、采样时，测试人员应站在采样口的下风侧。

5）结果计算

①用计数方法得出各个培养皿的菌落数。

②每个测点的浮游菌平均浓度的计算，见如下公式。

平均浓度（cfu/m3）= 

例1：某测点采样量为400L，菌落数为1，则：平均浓度=1／0.4=2.5 cfu／m3

例2：某测点采样量为2m3，菌落数为3，则：平均浓度=3／2=1.5 cfu／m3

6）结果评定

①每个测点的浮游菌平均浓度必须低于所选定的评定标准中关于细菌浓度的界限。

②若某测点的浮游菌平均浓度超过评定标准，则必须对此区域先行消毒，然后重新采样两次，两次测试结果必须合格。

4.7 采样点布置的规则

洁净室和洁净区采样点的布置力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，某局部区域过于稀疏。沉降菌采样点布置图示可作参考。

4.8 浮游菌的测定的标准，见表10

5.1 概述

在空气净化系统正常运行，送风、回风、排风正常开启的情况下进行。

5.2 使用仪器

使用风速仪，贴近于风口处规定位置进行检测风速。

5.3 检测规定位置

每个A级洁净工作台送风检测10 次，取其平均值，即为该风口的风速。

5.4 检测后，应及时填写“风速数检测记录”。

平均风速 V=

6 换气次数监测

6.1概述

换气次数就是置换空气的次数，也就是每个小时内进入室内的气体体积数是室内体积的多少倍。

6.2 设备仪器：风量罩，将风量罩对准出风口，检测出每小时的出风量

换气次数=