正文模版--青年科学基金

1. 立项依据与研究内容

（1）项目的立项依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是一种以关节软骨发生进行性退变，关节边缘骨赘形成和软骨下骨质反应性改变为特征的慢性关节病。主要临床表现是膝关节疼痛，活动功能受限，严重者可出现膝关节内、外翻畸形，行走困难。KOA已经成为严重影响中老年人生活质量的多发病。根据我国六城市中老年人群X 线膝骨关节炎流行病学分析显示40岁及以上男女人群X线KOA 总患病率为28.7%；在50岁以上的人口中，KOA的患病率为34.16%；在60岁以上的人口中，KOA的患病率高达43.94%[1]。严重危害着中老年人的健康，而中国一年因此而丧失劳动力的损失高达几十亿美元。随着社会人口的老龄化和逐渐增加的社会经济负担，KOA 被认为是一个重要的世界性卫生问题。

KOA发病机制有软骨细胞凋亡学说、自身免疫反应学说、软骨下骨内高压学说、自由基学说、细胞因子学说、软骨酶降解学说、软骨外因素影响学说、软骨机制内的稳态失衡学说等，可以认为由内外环境失衡以及两者之间的相互影响、互为因果的生物过程，最终导致了KOA的发生。具体包括：内应力失衡是引起本病的重要因素[2]；软骨细胞功能不全是本病演变的出发点，同时炎性介质从炎性滑膜释放入关节腔，是本病由关节结构受损害到出现临床表现的转折点；外伤磨损为KOA的直接损伤因素[3]，其中以髌股关节之间的压力升高尤为重要；静脉瘀滞、骨内高压是发病的原发因素[4]；酶在KOA的病理过程中起很大的作用[5]；细胞因子、氧自由基在致病病机中起参与作用[6]；微量元素、免疫功能、激素与本病有相关性[7]。

膝关节是人体全身关节中结构最复杂而最易受损伤的关节之一，关节软骨覆盖于关节表面，具有抗压及吸收震荡、传导分散应力等力学特性，从而保护关节骨骼及附属器官不会因为承受瞬间巨大冲击而受损[8]。关节软骨属于透明软骨，厚约1-5mm，由软骨细胞与细胞外基质组成，基质主要包括20％的II型胶原原纤维，也有少量V、VI、IX、X、XI型胶原，75％左右的含Na+电解质液及5％带负电荷的蛋白多糖[3]。KOA如同其他OA一样，是机械性和生物性因素的作用，破坏了关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨正常合成与降解耦联的结果[9]。尽管KOA发病既与年龄、性别、种族、遗传、体质、气候等多种原发性因素相关，也与创伤、炎症、免疫、代谢异常等继发性因素相关，其发病机制的假说有软骨细胞凋亡学说、自身免疫反应学说、软骨下骨内高压学说、自由基学说、细胞因子学说、软骨酶降解学说、软骨外因素影响学说、软骨机制内的稳态失衡学说等[10]。然而最终，KOA通过软骨细胞和细胞外基质在形态学、生物化学、分子生物学和生物力学等方面的改变表现出来，这些改变导致关节软骨软化、纤维化、溃疡、缺失，软骨下骨的硬化和骨质象牙化，骨赘形成和软骨下囊变。由于关节软骨是膝关节OA早期和主要的受损组织，OA临床治疗的重点在于保护和修复关节软骨。近年来随着生物技术、组织工程技术的发展，关节软骨的实验研究取得了多方面的进展，由此为成功治疗关节软骨损伤带来了更多更好的方案，软骨损伤修复是国内外骨科工作者历来所关注的研究热点[11]。虽然目前缺乏效果显著的治疗方案，但一些新手段正在积极探索中，如软骨细胞自体移植(Autologous chondrocyte implantation，ACI)、软骨移植(Osteochondral transplantation)和微骨折术(microfracture，MFX)等[12、13]。

推拿手法产生不同形式的“动态力信号，作用于受术部位的各种感受器，感受器受到刺激后不同程度地发放动作电位并向中枢传导相关感觉的神经冲动，再经过神经中枢的整合与反馈，从而发挥手法的治疗作用[14]。扌袞法、拿揉法、按揉法常作为放松下肢肌肉及膝关节周围软组织的基础手法,缓解膝周肌肉、肌腱、韧带等软组织的紧张和痉挛。弹拨手法作用于膝周痛点、压痛点以及其它出现“筋结”的位置，垂直于肌腱和肌纤维走向，作深入的、较重的弹拨,弹筋拨络力重而深透，以达刺激经络、松解粘连之效，即“坚者软之、结者散之”[15]。“以痛为输”手法作为推拿的一部分，最早记载于《灵枢•经筋》：“经筋之为病，燔针劫刺，以知为数，以痛为输”。即以疼痛部位或以压痛之处为腧穴，不必拘于经穴所限，经过后世医家临床实践证实有效。李征宇[16]等人应用脑功能核磁共振(fMRI)技术发现，在疼痛处按揉后，能同时影响疼痛回路和愉悦回路，表明推拿与镇痛和愉悦作用可能密切相关。而且，“以痛为输”按揉法可使腰椎间盘突出症患者具有镇痛作用的血清β-内啡肽含量明显升高，血清p物质含量明显降低。张峻峰[17]等人研究发现根据“以痛为输”理论，应用“滞针法”针刺后配合“一指禅”手法可有效缓解疼痛和压痛等临床症状，其对肌肉痉挛、关节活动的改善方面优于扶他林乳剂局部涂抹按摩治疗。可见，“以痛为输”推拿的临床镇痛效果显著。

祖国医学认为，OA属于“痿证”、“瘦症”、“骨痹”范畴，气血营卫内虚是致病的内在因素，风寒湿邪外袭是致病的外在因素,经络气血阻滞则是瘦证的主要病机。《素问上古天真论》曰:“肾气盛，齿更发长，肾气平均，故真牙生而长极。筋骨坚，发长极，筋骨劲强，肌肉满壮。”“肾气衰，面焦发白，筋不能动，齿发去，形体皆极。”《内经》云:“膝者筋之府，屈伸不能，行则偻附，筋将惫矣。”可见，肾虚不能主骨生髓；肝肾同源，肾虚则肝亦虚,肝虚则无以养筋以束骨、利关节；筋骨充养不足,则萎软无力，逐渐发展到筋骨枯萎而发生软骨的退行性改变。《素问瘦论》云：“风寒湿三气杂至，合而为瘦。……瘦在骨则重，在脉则血凝而不流,在筋则屈不伸，在肉则不仁，在皮则寒。”“荣者，水谷之精气也,和调于五脏，洒陈于六府，乃能入于脉也，故循脉上下，贯五脏，络六府也。”。

综上所述，目前推拿对于KOA具有一定的临床防治效果，临床经验总结文献居多。现在研究方向主要集中在：软骨细胞的合成与降解、软骨的损伤与修复、骨内压等，研究关节与肌肉之间的关系。既然推拿（手法及）临床疗效确切，临床上KOA患者多是关节软骨发生进行性退变，进而导致步态失稳，可见软骨在膝骨关节炎的发病机制中起重要作用，那么推拿（按揉等手法）治疗膝骨关节炎就存在通过“推拿－关节周围软骨再生-软骨生物力学环境改善”通路发挥作用的理论依据及可能性。因此，本研究的意义在于从推拿学、解剖学、生物力学、分子生物学多学科结合交叉的角度，解决基于推拿手法治疗促进膝关节软骨修复的作用机制。项目完成后可将推拿作为防治KOA的综合疗法之一，同时减少药物的应用量及副作用，降低治疗费用，提高疗效。

参考文献：1.李宁华,薛庆云，张毅等.中国六城市中老年人群X线膝骨关节炎流行病学分析[J]. 实用医学杂志,2008,24（16）：2887-2888.

2.李国衡.骨关节损伤魏氏伤科与中西医结合治疗.北京:人民军医出版社,2002,167.

3.吕厚山,陈坚.关节炎外科学.北京:人民军医出版社,2002,263.

4.娄思权.骨关节炎的病理与发病因素.中华骨科杂志.1996,16(1):60-62.

5.孙刚.膝关节OA中医的治疗评述.中医杂志,2000,31(2):116-117.

6.Zivanovic, S., L. P. Rackov, et al. Cartilage Oligomeric Matrix Protein-flammation biomarker in knee osteoarthritis,Bosn J Basic Med Sci,2011,11(1): 27-32.

7.Pierzchala, A. W., D. J. Kusz, et al. CXCL8 and CCL5 expression in synovial fluid and blood serum in patients with osteoarthritis of the knee. Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2011,59(2): 151-155.

8.BefisAE，Lykissas MGPapageorgiou CD，Georgoulis AD．Advances in articular cartilage repair[J]．Injury，2005，36(4)：14-23.

9.VerstraeteKL，Almqvist F，et a1．Magnetic resonance imaging of cartilage and cartilage repair．Clinical Radiology，2004，59：674-6.

10.谢利民.骨关节炎诊断与治疗[M].北京：人民卫生出版社，2008.

11.Kaczmarczyk J,Sergiew M, Nowakowski A, et al.Walking ability after treatment of the knee osteoarthritis with OSTEO system[J]. Chir Narzadow Ruchu Ortop Pol, 2006,71(6):427-429.

12.徐杨俊.关节软骨损伤修复的研究进展[J].医学研究生学报2010,8,23(8):8-0.

13.李元城.关节软骨损伤治疗进展[J].Med J Chin PLA, 2013,5(38)：423-427.

14.龚利.一指禅推拿治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察[J].按摩与导引,2005,21(6):9-11.

15.王学宗,曹月龙，王翔等.手法治疗膝骨关节炎的系统回顾[J].中国中医骨伤科杂志，2011,2,19（2）:3-5.

16.李征宇,孙兮文,张效初,陈培青,沈雪勇,严隽陶. 按揉委中穴对脑愉悦回路的影响[J]上海中医药大学学报,2008,04:51-53.

17.张峻峰,吴耀持,宓轶群.“以痛为输”治疗肌筋膜疼痛综合征疗效观察[J]. 中国针灸,2009,09:717-720.（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）

2.1 研究内容

（1）软骨细胞数量的测定：从每组20例髌骨软骨横切片中，每例随机各取1张切片，每张切片随机抽测软骨细胞的数量，然后计算出其均值。

（2）髌骨软骨应力松弛、蠕变、刚度和强度的测定。

（3）软组织生物力学功能测定：在MTS 万能材料机上测定髌韧带的拉伸位移变化情况。

2.2 研究目标

(1) 探索推拿治疗KOA 的客观物质基础

(2) 印证“筋骨并重”的中医理论，为KOA 患者提供积极有效的治疗手段。

2.3 拟解决的关键问题

(1) 按揉手法的量化问题：手法的频率、作用时间可以量化，操作力的量化拟在本院中医药管理局三级生物力学实验室已经制作的指套式压力传感器基础上细化解决。

(2) 测量横切片上软骨细胞数量：采用苏木精-伊红（HE）染色观察软骨细胞形态变化；免疫组化检测软骨细胞数量。测定由本院国家中医药管理局三级实验室－免疫实验室完成。

（3）拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

3.1研究方案之动物实验部分

3.1.1实验动物

健康成年新西兰大白兔80只，7-10月龄，雌雄各半，平均体重约2.5kg。其中20只用于造模及髌骨软骨细胞取材预实验用。其余60只用于本次研究实验。

3.1.2实验分组

将60只健康成年新西兰大白兔为A组（正常组n=20）、B组（空白对照组n=20），C组（推拿治疗组n=20）共三组。

3.1.3实验手段

(1) 造模方法

健康成年新西兰大白兔40只，雌雄各半，平均体重约2.5kg，石膏固定左下肢制作OA模型，固定范围自腹股沟下2.0 c m 处至足趾，膝关节伸直位，踝关节背伸60°。4周后去除石膏。（参照赵文海，赵长伟，闻辉等，家兔膝骨性关节炎的动物模型的建立，实验研究[J].2007,9(176):16-17）

(2)干预方法

推拿组及空白对照组予以按揉手法和空白对照处理。按揉：力量0.5kg、频率120次/分钟、时间20分钟/次。3次/周，共实施四周。（严隽陶.推拿学.北京：中国中医药出版社[M].2003：87）

(3)按揉手法的量化问题

手法的频率、作用时间可以量化，操作力的量化拟在本院中医药管理局三级生物力学实验室已经制作的指套式压力传感器基础上细化解决。

3.1.4 关键技术

(1)软骨组织形态学观察

实验采用HE染色方法。测定由本院国家中医药管理局三级实验室－免疫实验室完成。

1.1取材与固定:切取新西兰大白兔髌骨软骨组织,置于4%多聚甲酸溶液中固定48 h。

1.2脱钙与包埋:用10% EDTA-2Na脱钙8周后,将组织修剪为0.5 x 0.5 x 0.3 cm³大小,经70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇30 min两次、95%乙醇30 min两次、100%乙醇30 min两次、二甲苯透明30 min两次、55°C石蜡中30 min两次,用铜制模具包埋组织块。

1.3切片:用石蜡切片机将包埋的组织块切成厚度5 pin的组织切片,并附于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上,60℃过夜。

1.4脱蜡、入水:将切片浸于二甲苯中5 min两次、100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇5 min两次、自来水冲洗、PBS洗两次。

1.5 HE染色、观察:苏木素染液染色5-10 min,70%乙醇浸泡30 min,脱去胞质

着色,碱性液碱化,蒸馏水漂洗1min,伊红染液染色30-60sec,梯度乙醇脱水,二甲苯透明两次,干燥,封片,光学显微镜下观察软骨组织形态结构。

(2) 软骨细胞数量的测定

切取新西兰大白兔髌骨软骨组织,用3%戊二醛-1.5%多聚甲酸液于4℃固定72 h,0.1ml/L PBS漂洗;5.5%EDTA脱耗12周,将组织块修剪为1 x 1 x 2 mm³大小,0.1 mol/L PBS漂洗;1%四氧化锇置4°C固定2h,0.1 mol/L PBS漂洗,酒精-丙酮梯度脱水;经环氧树脂618包埋;半薄切片美蓝-天青染色,光镜辅助观察细微结构并定位;超薄切片70 nm,铀-铅染色,透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构变化, 切片在100×光镜下采用OLYMPUS数码照相机采集图像，并用显微图像分析仪（Moticdigital Microscope Ba Professional）进行观察分析。从每组20例软骨横切片中，每例随机各取1张切片，每张切片随机抽测软骨细胞的数量和面积百分比，然后计算出其均值。软骨细胞数量和面积百分比的测定用图像分析系统(image pro plus5.1)进行分析。

(3) 髌骨软骨应力松弛、蠕变、刚度和强度的测定。

♦标本制备

在兔架上固定兔子，耳后静脉空气栓处死，取下髌骨，以生理盐水浸湿的纱布包裹标本装入塑料袋中密封放至－20℃低温冰箱中保存待测。保存10~15天，实验前取出标本，在常温下解冻后，用骨刀沿髌骨软骨的细微裂隙方向切取软骨，修整成亚铃形小试样。实验装置采用MTS万能材料机，该机具有自动控制应力、应变增加速度和使应力、应变保持恒定的功能。

♦指标测定

用生理盐水洗浴拉伸配件后，将髌骨软骨标本两端固定于（MTS万能测试机）上准备实验。

应力松弛测试：传感器量程100N，以5mm/min的速度进行拉伸，达到试件长度的5%，停止拉伸，保持试件长度在5%不变，开始釆集数据。计算机程序设定时间从t(0)开始釆集数据，每0.1s釆集一个数据，历时1800 s。达到设定的时间后，记录数据和曲线。

蠕变测试：传感器量程100N，以5mm/min进行拉伸，达到4MPa时，停止拉伸，保持应力4MPa不变，开始釆集数据。计算机数据采集程序与应力松弛测试相同。

刚度和强度测试：传感器量程100N，以5mm/min的速度施加应力，达到最大载荷，拉伸至肌肉断裂。测定肌肉的强度极限(在一定实验条件下肌肉所能承受的最大张力，是衡量材料强度的重要指标)，最大伸长量(指肌肉张力达到最大时肌肉长度与原长度之差，是衡量材料刚度的重要指标)[32-37]，实验结束后计算出试样的最大位移、最大应力、强度模量、最大应变等。

(4) 生物力学试验

使用MTS万能材料机。在兔胫骨平台下和股骨干中1/3用骨钻钻孔，分别穿入直径2mm螺钉用弯钩固定，用自制夹具将股骨、胫骨分别与传感器连接。测量韧带初始长度。以5mm/min速度下降实验机，先以髌韧带原长的5%为位移进行三次预加载，后从原长的10%开始以1%为增量，进行正式加载试验。记录加载曲线直至内侧副韧带拉断或撕脱。

(5)KOA动物模型的造模问题

拟由课题组具有丰富造模及实验研究经验的病理科医师，按照文献提供的常用造模方法实施造模。

3.1.5观察指标

软骨细胞数量的测定、髌骨软骨应力松弛、蠕变、刚度和强度的测定、髌韧带的拉伸位移变化。

3.1.6统计方法

随机数字表由spss18.0统计软件经随机种子数生成。均数正态分布采用成组设计方差分析，计数资料及非正态分布采用秩和检验。统计由上海中医药大学统计教研室完成。

3.2技术路线

（4）本项目的特色与创新之处。

运用整体系统化的研究方法应用于动物实验的研究；用现代科技手段揭示推拿手法产生疗效的客观物质基础。为今后对膝骨关节炎患者推拿治疗的标准化提供临床依据和理论基础。

关于“推拿－关节周围软骨再生-软骨生物力学环境改善”特异性研究的相关论文在科技论文数据库中未检索到，属国内外首创。

（5）年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）5.1 年度计划

2016.1-2017.6 建立KOA动物模型。

2016.7-2017.6完成预初实验及其相关数据分析。

2017.7-2018.7对正式实验动物进行造模及治疗。采集处理相关标本，进行酶学指标、MTS相关指标测试，完成实验。

2018.8-2018.12 数据整理与统计分析，完成总结报告，组织学术交流活动。5.2 预期成果

(1) 通过本课题研究，完善对KOA发病的解剖学、生理学、生物力学认识，为推拿手法作用机制提供客观依据。

(2) 在核心期刊上发表论文5篇，SCI 发表论文1篇。

2. 研究基础与工作条件

（1）工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

1.1前期研究基础

以严隽陶教授为首的岳阳中西医结合医院课题组进行了推拿手法结合易筋经防治老年骨骼肌减少症的研究。先后承担了国家中医药管理局科研项目“静力推拿训练对β-内啡肽基因表达的影响”（国家中医药管理局课题97A111），上海市卫生局科研项目“推拿防治老年骨骼肌减少症的临床和实验研究”（上海市卫生局科研项目

00-P-08）。推拿防治老年性骨骼肌衰弱的临床研究2004年通过上海市卫生局科技成果鉴定，2007年获上海市科技成果三等奖。

（严隽陶,张宏,徐俊等.静力推拿训练对最大摄氧量的影响[J].按摩与导引,2002,18（3）:12-13.)

本院房敏、龚利主任医师带领的课题组应用等速肌力测试技术客观观察了推拿手法对KOA患者屈伸肌群的影响，证实推拿手法治疗可以提高膝骨关节炎患者屈伸肌群肌力、做功和功率，有利于巩固和维持膝关节的稳定性，改善膝的屈伸功能，促进膝关节功能的恢复。（龚利,房敏,严隽陶等.手法治疗对膝骨关节炎患者屈伸肌功能影响的临床研究[J].中国中医骨伤科杂志,2011,19(2):6-9.）

1.2 相关技术支持和人才梯队

课题组已进行相关研究多年，对于动物模型的制作、实验方法、检测方法等项目都能熟练操作，并取得相关研究结果，培养相关人才。

（2）工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研究基地的计划与落实情况）

（1）拥有结构合理的课题研究人员梯队。具备专门从事推拿防治KOA 的临床与实验研究人员，及熟练掌握实验技术的专职研究人员。（2）拥有完成课题研究所需的实验室条件。本院生物力学实验室是国家中医药管理局三级实验室，已经制作完成指套式压力传感器。免疫实验室是国家中医药管理局三级实验室，具有NO、NOS测定和脊神经节、脊髓HRP—NOS双标记神经元计数所需设备及实验资质与能力。拥有符合标准的动物实验中心。

（3）拥有课题研究所需的关键仪器设备。具备病理观察、免疫组化检测、生物力学试验等所需仪器设备。（如：SAKURA-PB-150型自动脱水机、SAKURA包埋中心、MEDIS WEBER旋转石蜡切片机、YABO200漂烘片机、GNP-9080隔水式恒温培养箱、OLYMPUS-BX51显微照相系统、ABI7000型荧光定量PCR仪、ABI Prism7000SDS Software分析软件、SIGMA TYPE B2型生物安全柜、SIGMA 1-15K15型低温冷冻离心机、XW-80A旋涡振荡2、K10CD型干式恒温器、BDC-280e型冷藏冰箱、ZXC 型紫外杀毒车、MTS万能材料机等。）

（4）上海中医药研究院统计教研室具有卫生经济学统计软件及课题设计、数据统计分析能力。

（3）承担科研项目情况（申请人正在承担或参加科研项目的情况，包括国家自然科学基金的项目。要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）

（1）静力推拿训练对β-内啡肽基因表达的影响

国家中医药管理局课题（97A111）已完成。（参与指标检测）

（2）推拿防治老年骨骼肌减少症的临床和实验研究

上海市卫生局科研项目（00-P-08）已完成。（参与病例收集）（3）滾法与膝骨关节炎患者屈伸肌功能的相关性研究

上海市重点学科（T23032）2006.1-2008.12已完成。（参与病例收集）该研究证实：膝骨关节炎患者普遍存在屈伸肌群功能下降的病理表现,中医推拿手法具有提高肌群功能的生物学效应,从而纠正膝关节生物力学紊乱,有利于维持髌骨关节稳定性, 改善伸膝功能,帮助恢复膝关节正常的生物力学规律,促进膝关节整体功能的恢复。以上项目与本次实验均有相关性。

（4）完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个

已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）

无。

3. 资金预算说明

购置单项经费5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。

无。

4. 其他需要说明的问题

无。