《分子生物学检验技术》实验指导

【实验目的】

把握动物组织DNA提取的方法；

把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。

【实验原理】

获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。

DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。

260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。

【实验器材和试剂】

1、动物

小白鼠

2、设备

移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。

3、试剂

（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K

（7）生理盐水，4℃贮存

（8）无水乙醇、70%乙醇

【操作步骤】

1、制备肝匀浆

迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。

2、提取DNA

（1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。

（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。

（3）加入1/3体积的Buffer PP，涡旋震荡20 s，12000 rpm离心3 min。

（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。12000 rpm离心1 min，弃上清。

（5）加入300 μl 70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000 rpm离心1 min，弃上清，室温干燥15 min。

（6）加入50 μl Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比较大，能够65℃孵育以促进DNA的溶解），室温储存待测。

3、DNA浓度和纯度的测定

取0.1 ml DNA样品，加蒸馏水至1 ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。

运算：DNA浓度（μg/ml）= A260×50×10 （请咨询系数50、10是如何得来的？）

      DNA纯度 = A260nm/A280nm

【注意事项】

（1）由于DNA要紧存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破裂要严格操纵好。即要尽可能的将细胞膜破裂，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。为幸免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。

在提取过程中，染色体会发生气械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温顺的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。

（2）用氯仿除去组织蛋白，要持续振荡使蛋白质变性。如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

（3）酚和氯仿均有专门强的腐蚀性，操作时应幸免接触皮肤。

（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会阻碍内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。

（5）提取过程应尽量保持低温。

（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。据此来运算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。

（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。应按照后续实验要求，采取不同的方法纯化。因此也会显现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情形，因此有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。

【结果】

1、A260 =               ，A280 =                 。

2、小鼠肝组织中DNA浓度是                μg/ml。

3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是            。

【摸索题】

提取和纯化的真核组织DNA有何用途？

你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？有何意义？

请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？

实验二  聚合酶链反应

【实验目的】

    采纳聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因

【实验原理】

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。反应中使用两条化学合成的寡核苷酸作为引物，分不与模板DNA两条单链互补，待扩增序列片段位于两条引物之咨询。PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参与。反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。当温度升至72℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5 ‘向3’方向持续延伸，直至形成新的DNA双链。通过变性、退火和延伸的一个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加一倍。由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板通过n个循环可得2n个分子拷贝产物。

本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。扩增所用的上游引物序列为：5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。

【实验器材和试剂】

1、设备

PCR仪、0.2ml PCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。

2、试剂（20 μl体系）

PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）

【操作步骤】

分不在PCR反应管中加入2× PCR mix 10 μl、上游和下游引物各2 μl、DNA 2 μl和H2O 4 μl。

把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。本实验的扩增程序为：94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min。重复35个循环后，于72℃再延伸10 min，最后4℃保温。

反应终止后，将PCR反应管于12000 rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。

【注意事项】

1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。因此，必须采取相应措施幸免发生污染。

2、PCR实验应当设置阴性对比反应，即在反应体系中不加模板DNA。

3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，并分装于PCR管中，然后再在各管中分不加入模板。

4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。

5、PCR试剂与模板DNA及样品应分不储存于不同功能区的冰箱中。

6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分不使用专用的移液器，所有耗材使用前必须经高压灭菌，用后按规定处理并丢弃在指定容器中。

【结果】

【摸索题】

PCR各组分在反应中的作用是什么？

降低退火温度、延长变性时刻会对反应有何阻碍？

实验三  琼脂糖凝胶电泳

【实验目的】

把握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

【实验原理】

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用专门广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用技术。

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也能够分离相对分子质量相同，及构型不同的DNA 分子。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，一般琼脂糖凝胶分离DNA的范畴为0.2-20kb，其辨论率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范畴广。

荧光染料溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中形成复合物，紫外光照耀下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量。由于EB是致癌剂，现在开发出了安全的染料，如Syber Green、GelRed、GoldView等。

【仪器与试剂】

1. 仪器

天平、锥形瓶、微波炉（或电炉）、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪（或紫外线透射仪）、微量可调移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。

2. 试剂

（1）50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242.0g、冰乙酸57.1 ml、EDTA 63.5g、NaOH 10.0g，加蒸馏水至1000 ml，使用前用蒸馏水稀释至1×TAE电泳缓冲液。

（2）6×loading buffer ：( 0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液)或（0.25％ 溴酚蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液），贮存于 4℃。

（3）电泳级琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液: 将EB 配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNA Marker、DNA、蒸馏水。

【实验步骤】

1．配制1.5％的琼脂糖凝胶：

精确称取1.5g电泳级琼脂糖，加入100 ml 1×TAE电泳缓冲液，在微波炉里（或电炉）加热使琼脂糖颗粒完全溶解（加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发），待胶冷却至55ºC左右时，加入20µl溴化乙锭（也可先不加EB，而是电泳后再用0.5µg/ml 的EB 溶液浸泡染色），轻轻旋转混匀。插入合适的梳子，将溶液倒入制胶板中，待凝聚后拔去梳子待用。

2. 加样：

将凝胶置于电泳槽，加入1×TAE电泳缓冲液覆盖胶面即可。各取PCR产物和DNA分子量参照物10 µl DNA加入1µl 6×loading buffer，混合后上样，分不加入琼脂糖凝胶孔内。加样时切勿破坏点样孔周围的凝胶。

3. 电泳：

合上电泳槽盖，打开电泳仪，操纵电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。

4. 染色：

未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。

5. 观看和拍照：

电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于凝胶成像分析仪上观看电泳结果，并照相记录。或在波长为254 nm的紫外灯下观看DNA的荧光条带。紫光灯下观看时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损害眼睛。 

【注意事项】

1．阻碍DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

（1）DNA大小：迁移速率与log N成反比（N为碱基对数目）。分子越大，迁移越慢。分子量相同的空间结构越紧密的电泳越快，如超螺旋>线性DNA。

（2）琼脂糖凝胶浓度：不同的凝胶浓度，辨论不同范畴的DNA ：

（4）所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使辨论成效好，凝胶上所加电压不应超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃。

（5）嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中）。

（6）电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度阻碍DNA的迁移率。无离子存在时，核酸差不多不泳动；离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性。一样采纳1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染，凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

【实验结果与分析】

1．电泳过程中，你自己或本组所采纳的电压为________伏特（v），电流为_______毫安（mA），通电时刻为_______分钟。

    2．在实验报告上描画自己或实验组的电泳图谱，标明阳极和阴极位置。

【摸索题】

你的电泳结果如何？成功或失败有哪些方面的缘故？进行琼脂糖凝胶电泳时应注意哪些咨询题？