顺铂与紫杉醇联合应用对小鼠宫颈癌组织中Bcl-2、Bax、Caspase-9表达的影响

黄彤辉

（南华大学附属南华医院，湖南衡阳４２１００１）

　　摘要：目的　观察顺铂（ＤＤＰ）与紫杉醇（ＴＸＬ）联合应用对宫颈癌小鼠宫颈癌组织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、半胱氨酸蛋白酶９（Ｃａｓｐａｓｅ－９）表达的影响。方法　３２只６１５小鼠均建立小鼠宫颈癌模型，后随机分为Ａ组９只、Ｂ组９只、Ｃ组１０只、Ｄ组１０只。Ａ组小鼠皮下注射生理盐水０．２ｍＬ，每６天１次。Ｂ组小鼠皮下注射ＤＤＰ４ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每６天１次。Ｃ组小鼠腹腔注射ＴＸＬ５０ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每周１次。Ｄ组小鼠皮下注射ＤＤＰ４ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每６天１次；ＴＸＬ５０ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每周１次；第１次注射时先注射ＴＸＬ后注射ＤＤＰ，其后两药序贯用药。采用免疫组化ＳＰ法检测各组Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９。结果　Ａ组宫颈癌组织Ｂｃｌ－２表达量为６３００．４３±４５８．３４、Ｂａｘ表达量为７２４４．２２±３６３．７２、Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２为１．１４±０．３１、Ｃａｓｐａｓｅ－９表达量为５１４４．２２±３６３．７１，Ｂ组分别为４１４６．５６±２０２．５０、６６１３．８９±２３７．４９、１．５９±０．２２、６９１３．８９±３３７．４９，Ｃ组分别为５３６１．２０±３６７．８０、６２１０．５０±３２０．２５、１．１５±０．３１、９３１０．５０±２２０．２５，Ｄ组分别为１９５０．８０±１０３．３１、９３３４．４０±４７１．５３、４．７９±１．３４、１０３３４．４０±３５１．５３，Ａ、Ｂ、Ｃ组分别与Ｄ组比较，Ｐ均＜０．０５。结论　与单用ＤＤＰ、ＴＸＬ比较，ＤＤＰ联合ＴＸＬ化疗可明显降低Ｂｃｌ－２水平，增加Ｂａｘ蛋白水平和激活Ｃａｓｐａｓｅ－９，从而达到促进宫颈癌细胞凋亡的作用。

　　关键词：顺铂；紫杉醇；宫颈癌；白细胞介素２；半胱氨酸蛋白酶９　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１５．２３．００９

　　中图分类号：Ｒ７１１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１５）２３－００２６－０２

基金项目：湖南省科技厅计划项目（２０１３ＦＪ６０６８）。

　　联合化疗可显著提高单个化疗药物的抗肿瘤效力，同时可明显减轻化疗药物的毒性反应。紫杉烷类与铂类之间存在交互作用，其合并效应呈现出不同程度的相加。目前，顺铂（ＤＤＰ）和紫杉醇（ＴＸＬ）联合化疗已成为治疗宫颈癌常用的化疗方案。小剂量ＤＤＰ和ＴＸＬ联合化疗方案的抗癌作用与肿瘤细胞凋亡是否有关未见相关报道。以往研究显示，ＤＤＰ和ＴＸＬ联合化疗对小鼠宫颈癌细胞有促凋亡作用，但其相关机制鲜有报道。本研究观察了ＤＤＰ联合ＴＸＬ化疗对小鼠宫颈癌细胞Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、半胱氨酸蛋白酶９（Ｃａｓｐａｓｅ－９）表达的影响，进一步讨论ＤＤＰ、ＴＸＬ联合化疗对小鼠宫颈癌细胞促凋亡作用的可能机制。１　材料与方法１．１　细胞株及实验动物　小鼠宫颈癌Ｕ１４细胞株。实验用６１５小鼠３２只，雌性１３只，雄性１９只；１８～２２ｇ，４～６周；ＤＤＰ每支１０ｍｇ、ＴＸＬ每支３０ｍｇ；小鼠Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ单克隆抗体及兔Ｃａｓｐａｓｅ－９多克隆抗体。１．２　模型制备及顺铂、紫杉醇干预　每只小鼠右腋

窝皮下接种０．１ｍＬ（１×１０６

个宫颈癌Ｕ１４细胞），接种１０ｄ后，可扪及皮下结节状瘤体。当小鼠皮下结节状瘤体直径约６ｍｍ（１００ｍｍ３

）且无并发症即可入选注药。小鼠随机分为Ａ组９只、Ｂ组９只、Ｃ组１０只、Ｄ组１０只。Ａ组小鼠皮下注射生理盐水０．２ｍＬ，每６天１次。Ｂ组小鼠皮下注射ＤＤＰ４ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每６天１次。Ｃ组小鼠腹腔注射ＴＸＬ５０ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每周１次。Ｄ组小鼠皮下注射ＤＤＰ４

ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每６天１次；ＴＸＬ５０ｍｇ／（ｋｇ・ｍＬ），每周１次；第１次注射时先注射ＴＸＬ后注射ＤＤＰ，其后两药序贯用药。待各组中出现第１只小鼠死亡为治疗终

止时间点，处死全部实验用小鼠，切除完整肿瘤组织，用１０％中性甲醛溶液浸泡固定，乙醇梯度脱水后石蜡包埋，常规切片（４μｍ厚）。１．３　宫颈癌组织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９检测　采用免疫组化ＳＰ法。用ＰＢＳ液代替一抗作阴性空白对照。Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ及Ｃａｓｐａｓｅ－９一抗工作浓度分别为１∶１５０、１∶１００、１∶１００。以ＰＢＳ代替一抗作为空白对照。一抗孵育４℃过夜，镜下控制染色，Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ及Ｃａｓｐａｓｅ－９阳性反应均表现为定位于胞膜和胞质内棕黄色或棕褐色细小颗粒。每张免疫组化片随机选取１０个高倍视野，使用免疫组化图像分析软件测

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２山东医药２０１５年第５５卷第２３期

１．４　统计学方法　采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件。计量资料以珋ｘ±ｓ表示，多组间比较采用方差分析。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果

　　各组宫颈癌组织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９表达比较见表１。

表１　各组宫颈癌组织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９

表达比较（珔ｘ±ｓ）

组别Ｂｃｌ－２ＢａｘＢａｘ／Ｂｃｌ－２Ｃａｓｐａｓｅ－９Ａ组６３００．４３±４５８．３４倡７２４４．２２±３６３．７２倡１．１４±０．３１倡５１４４．２２±３６３．７１倡Ｂ组４１４６．５６±２０２．５０倡６６１３．８９±２３７．４９倡１．５９±０．２２倡６９１３．８９±３３７．４９倡Ｃ组５３６１．２０±３６７．８０倡６２１０．５０±３２０．２５倡１．１５±０．３１倡９３１０．５０±２２０．２５倡Ｄ组１９５０．８０±１０３．３１９３３４．４０±４７１．５３４．７９±１．３４１０３３４．４０±３５１．５３

　　注：与Ｄ组比较，倡Ｐ＜０．０５。

３　讨论

　　联合、间隙、持续化疗为目前恶性肿瘤主要的抗癌方案。２０１４年ＦＩＧＯ指南指出，ＤＤＰ和ＴＸＬ联合化疗为宫颈癌的常用化疗方案［１］。目前研究认为，ＴＸＬ通过结合到微管蛋白上，从而促进微管蛋白的聚合。ＤＤＰ于１９７８年首先在美国批准于临床应用，为第一代铂类抗肿瘤药物，具有广谱的抗肿瘤作用，迄今为止是被公认为最有效的化疗药物之一，并被推荐用于复发或远处转移宫颈癌患者的一线单药化疗，ＤＤＰ阻碍ＤＮＡ合成及复制，从而抑制肿瘤细胞的生长［２］。细胞凋亡是一种或多种刺激因素诱发的程序性破坏过程，是由相关基因介导的细胞生理死亡方式，它对维持机体内外环境的恒定具有重要意义。生理性细胞凋亡对维持正常的生命活动是必需的，而药物诱导的病理性凋亡同样具有重要的临床意义。凋亡诱导产生的Ｃａｓｐａｓｅ级联反应有两条信号转导途径，即内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径。多数抗肿瘤药物即通过内源性线粒体途径发挥细胞毒性作用，最终导致细胞凋亡。

Ｂｃｌ－２家族分为Ｂａｌ－２和Ｂａｘ两大亚族，Ｂａｌ－２家族中包括Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ和Ｂｉｍ，通过形成一个通道启动线粒体通透性转变孔改变膜对一些离子、小分子或蛋白质的通透性而参与细胞凋亡的。定位于内质网膜上的Ｂｃｌ－２为公认的Ｂｃｌ－２家族蛋白成员中主要抗凋亡分子。Ｂｃｌ－２通过干扰细胞色素Ｃ及Ｃａ２＋的释放，降低核酸内切酶活性，导致细胞色素Ｃ无法达到激活下游胱冬肽酶的阈值，从而保护细胞器功能，抑制细胞凋亡。而Ｂａｘ是促凋亡基因，Ｂａｘ的Ｎ端暴露，引起细胞色素Ｃ和各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡［３～７］。Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２的比值决定了细胞是否凋亡。Ｃａｓｐａｓｅ－９是天门冬氨酸蛋白酶家族中１３种Ｃａｓｐａｓｅ的主要成员之一，是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，处于凋亡的始动阶段，一旦被激活，即发生下游的级联反应，导致细胞凋亡［８～１１］。Ｃａｓｐａｓｅ－９主要在内源性细胞凋亡途径中活化，从而激活效应Ｃａｓｐａｓｅ－３导致细胞凋亡。从阳性信号分布来看，Ｃａｓｐａｓｅ－９主要位于肿瘤细胞质，从阳性表达率来看，Ｃａｓｐａｓｅ－９在肿瘤细胞中的表达率与正常组织无差异。说明Ｃａｓｐａｓｅ－９在正常组织中的表达也是一个经常性的事件。但是Ｃａｓｐａｓｅ－９在抗癌治疗过程中表达量增加可能有助于此肿瘤的治疗，

Ｃａｓｐａｓｅ－９的高表达在促进细胞的凋亡中发挥重要作用［１２，１３］。本研究显示，与单用ＤＤＰ或ＴＸＬ相比，ＤＤＰ联合ＴＸＬ化疗可降低Ｂｃｌ－２水平，增加Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９表达及Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２。

参考文献：

［１］ＦＩＧＯｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃｏｎｃｏｌｏｇｙ．ＦＩＧＯｓｔａｇｉｎｇｆｏｒｃａｒｃｉ－ｎｏｍａｏｆｔｈｅｖｕｌｖａ，ｃｅｒｖｉｘ，ａｎｄｃｏｒｐｕｓｕｔｅｒｉ［Ｊ］．ＩｎｔＪＧｙｎｅｃｏｌＯｂ－ｓｔｅｔ，２０１４，１２５（８）：９７－９８．

［２］ＲａｎｄｉｎａＧ，ＤｉｓｔｅｆａｎｏＭＧ，ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏＲ，ｅｔａｌ．Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｅｐｉ－ｒｕｂｉｃｉｎ，ａｎｄｃｉｓｐｌａｔｉｎ（ＴＥＰ）ｒｅｇｉｍｅｎａｓｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎ

ｌｏｃａｌｌｙａｄｖａｎｃｅｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ：ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｒｅｓｕｌｔｓ［Ｊ］．Ｇｙｎｅｃｏｌ

Ｏｎｃｏｌ，２０１３，１２８（３）：５１８－５２３．

［３］ＨｅｉｓｅｒＤ，ＬａｂｉＶ，ＥｒｌａｃｈｅｒＭ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＢｃｌ－２ｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙａｎｄ

ｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ，

２００４，３９（８）：１１２５－１１３５．

［４］ＥｓｋｅｓＲ，ＤｅｓａｇｈｅｒＳ，ＡｎｔｏｎｓｓｏｎＢ，ｅｔａｌ．Ｂｉｄｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅｏｌｉ－ｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆＢａｘｉｎｔｏｔｈｅｏｕｔｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍ－ｂｒａｎｅ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０００，２０（３）：９２９－９３５．

［５］ＫａｔａｏｋａＴ，ＨｏｌｌｅｒＮ，ＭｉｃｈｅａｕＯ，ｅｔａｌ．Ｂｃｌ－ｒａｍｂｏ，ａｎｏｖｅｌＢｃｌ－２ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｔｈａｔｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｖｉａｉｔｓｕｎｉｑｕｅＣ－ｔｅｒｍｉｎａｌｅｘｔｅｎ－ｓｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０１１，２７６（２２）：１９５４８－１９５５４．

［６］ＣａｇｎｏｌＳ．Ｒａｆ－１ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｅｖｅｎｔｓｃａｓｐａｓｅ９ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｄｏｗｎ－ｓｔｒｅａｍｏｆａｐｏｐｔｏｓｏｍｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔ，２０１１，

（２０１１）：８３４９４８．

［７］胡向阳，孟刚，鲍扬漪，等．紫杉醇诱导Ｈｅｌａ细胞凋亡及其与凋亡相关蛋白的关系［Ｊ］．中国药理学通报，２００４，２０（９）：１０６３．［８］张斌，宋国华，王海龙．氟对体外培养的小鼠睾丸间质细胞增殖和细胞凋亡的影响［Ｊ］．中国实验动物学报，２０１１，１９（１５）：４３７－４４０．［９］曹双双，苏安平，杜晓炯，等．Ｂｃｌ－２在胰腺癌中的表达及其相关性研究［Ｊ］．四川大学学报（医学版），２０１２，４３（２）：１５６－１６０．［１０］ＦａｎＴＪ，ＸｉａＬ，ＨａｎＹＲ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＳｉｎ，２０１１，３３（１）：７－１２．

［１１］岳原亦，张扬．Ｃａｓｐａｓｅｓ家族与细胞凋亡［Ｊ］．中国医疗前沿，２０１１，６（７）：２５－２６．

［１２］ＳｉｎｇｈＳＳ，ＫａｎｇＰＭ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃａｒｄｉｏ－ｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒＰｈａｒｍＤｅｓ，２０１１，１７（８）：１７８３－１７９３．［１３］ＢｒｏｏｋｓＣ，ＤｏｎｇＺ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｄｙ－ｎａｍｉｃｓｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙＢｃｌ－２ｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｋｅｙｉｎＢａｋ

［Ｊ］．ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ，２００７，６（１１）：３０－４３．（收稿日期：２０１５－０２－１３）

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山东医药２０１５年第５５卷第２３期

顺铂与紫杉醇联合应用对小鼠宫颈癌组织中Bcl-2、Bax、

Caspase-9表达的影响

作者：黄彤辉

作者单位：南华大学附属南华医院,湖南衡阳,421001

刊名：

山东医药

英文刊名：Shandong Medical Journal

年，卷(期)：2015(23)

引用本文格式：黄彤辉顺铂与紫杉醇联合应用对小鼠宫颈癌组织中Bcl-2、Bax、Caspase-9表达的影响[期刊论文] -山东医药 2015(23)