干细胞-骨髓间充质干细胞-大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 1, 2012 Vol.16, No.14

ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

2487Department of

Obstetrics and

Gynecology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou

510282, Guangdong Province, China

Peng Yan ☆, Studying for doctorate, Department of Obstetrics and

Gynecology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou

510282, Guangdong Province, China pengyansisi@ 126.com

Corresponding author: He Yuan-li, Chief physician, Professor, Department of Obstetrics and

Gynecology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou

510282, Guangdong Province, China yahoo.com.cn

Received: 2011-08-26 Accepted: 2011-09-30

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪☆

彭 艳，何援利，朱少芳

Rat bone marrow mesenchymal stem cells labeled and tracked with PKH26

Peng Yan, He Yuan-li, Zhu Shao-fang Abstract Peng Y, He YL, Zhu SF. Rat bone marrow mesenchymal stem cells labeled and tracked with PKH26.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(14): 2487-2490. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 关键词：细胞标记；PKH26；骨髓间充质干细胞；移植；迁移转归

缩略语注释：BMSCs ：bone marrow mesenchymal stem cells ，骨髓间充质干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.14.004

彭艳，何援利，朱少芳. 大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪[J].中国组织工程研究，2012，16(14):2487-2490. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

0 引言

骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs)是定居于骨髓微环境中的一种成体干细胞，具有自我增殖、多向分化的潜能，已成为组织工程的理想种子细胞。近年有报道骨髓来源干细胞可能是子宫内膜干细胞的来源

[1-2]

。BMSCs 是否可以迁移至

子宫内膜参与生理性更新和损伤修复成为研究热点。标记示踪细胞是干细胞移植研究的重要环节。本实验采用PKH26对大鼠BMSCs 进行标记示踪，观察其对细胞形态、增殖、凋亡、周期、诱导分化等生物学特征的影响，并通过大鼠尾静脉移植观察其在大鼠子宫内膜组织中的

迁移情况，寻找一种长期稳定直观而又不影响细胞分化能力的标记示踪方法，为研究大鼠BMSCs 在子宫内膜组织中分化转归奠定实验基础。

1 材料和方法

设计：观察对比性实验。

时间及地点：于2011-03/06在南方医科大学珠江医院再生医学研究所完成。

材料：近交系SPF 级Wistar 雄性大鼠8只，4~6周龄，60~90 g ； Wistar 雌性大鼠10只，8~12周龄，100~140 g ，由南方医科大学动物中心提供，许可证号scxk(粤)：2006-0015。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

彭艳，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

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南方医科大学珠江医院妇产科，广东省广州市 510282

彭艳☆，女，1978年生，江苏省海门市人，汉族，南方医科大学在读博士，主要从事子宫内膜异位症及干细胞的研究。 pengyansisi@ 126.com

通讯作者：何援利，主任医师，教授，南方医科大学珠江医院妇产科，广东省广州市 510282

heyuanli310@ yahoo.com.cn

中图分类号:R394.2 文献标识码:A

文章编号:1673-8225 (2012)14-02487-04

收稿日期：2011-08-26

修回日期：2011-09-30 (20110720014 /D ·C)

主要试剂：

方法：

BMSCs 的分离、培养及扩增

[3-4]

：用3.6%的水合

氯醛腹腔注射麻醉Wistar 雄性大鼠后，无菌条件下取出胫骨和股骨，用DMEM-F12培养基冲洗骨髓腔，得到细胞悬液，转入离心管用1 000 r/min 离心5 min ，倒去上清液，沉淀用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基10 mL(添加青霉素100 U/mL 、链霉素100 g/mL)混匀后，各取5 mL 接种于75 mL (25 cm 2

)培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO 2培养箱中恒温培养。 3 d 后去除未贴壁细胞，三四天换液1次。细胞80%融合时，0.25%胰酶室温消化，用含体积分数10%胎牛血清的培养液终止消化反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，促进细胞脱壁。转入离心管1 000 r/min 离心5 min ，弃上清，细胞沉淀按1∶3比例传代扩增培养。

BMSCs 免疫表型分析：取第2代的大鼠

BMSCs 制成单细胞悬液，流式细胞仪检测CD34、CD44、CD45、CD29的表达。

PKH26标记BMSCs ：胰酶消化第2代大鼠

BMSCs 形成单细胞悬液，取2×107细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗1次，400 g 离心 5 min 形成松散的细胞团。吸去上清，细胞团上剩余液体小于25 μL 。根据试剂盒说明书加1 mL 稀释液C ，重悬细胞保证完全离散，别震荡。染色前，准备4×10-6 mol/L 的PKH26染液(用稀释液C 稀释)置于离心管中。尽快加1 mL 的2×细胞到1 mL 的2×染料，立即用吸管均匀快速混合样品，因为均匀的染色是在瞬间发生的。25 ℃孵育2~5 min ，定时轻轻颠倒离心管保证在25 ℃充分混匀。加入等量血清中止染色反应，孵育1 min ，用等量含血清培养基稀释中止的反应液。25 ℃ 400 g 离心10 min ，去上清。细胞团转入新试管中，洗3次。加10 mL 完全培养基，离心，重新悬置细胞到所需浓度，荧光显微镜下观察细胞染色情况。随机选取5个视野，计算标记率(暗视野下红色荧光细胞数/明视野下细胞总数)，平均值即为PKH26的即时标记率。留取部分细胞培养观察细胞复苏情况。

细胞增殖能力观察：取第3代的未标记细胞和

已标记细胞应用CCK-8试剂盒检测增殖能力，

连续检测7 d 。

细胞凋亡及细胞周期检测：收集第3代的未标

记细胞和已标记细胞，使用PI 染色法检测细胞周期，Annexin-V 法检测凋亡率。

BMSCs 成骨成脂诱导及鉴定：取第2代大鼠

BMSCs 进行PKH26荧光标记，以2×105个分别接种于25 cm 2培养瓶内进行成骨和成脂诱导，当细胞达到80%融合后将培养液更换诱导培养液。成骨诱导培养液成分为：含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.05 mmol/L 维生素C ，100 mmol/L 地塞米松。每3 d 更换诱导培养液，诱导14 d 后茜素红染色，倒置显微镜下观察染色情况。成脂诱导培养液成分为：含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，1 µmol/L 地塞米松， 0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌呤，0.2 mmo1/L 吲哚美辛，10 µmo1/L 胰岛素。每3 d 更换诱导培养液，诱导14 d 后油红O 染色，倒置显微镜下观察染色情况。

PKH26标记的BMSCs 在大鼠子宫内膜组织中的迁移分布：实验组5只雌性大鼠尾静脉注射

1×1010 L -1PKH26标记的BMSCs 1 mL 。对照组5只雌性大鼠尾静脉注射生理盐水1 mL 。移植后6周，取大鼠子宫冰冻切片后4，6-联脒- 2-苯基吲哚(DAPI)染核，荧光显微镜观察PKH26标记的BMSCs 在子宫内膜组织的分布情况。

主要观察指标：BMSCs ①的鉴定。PKH26②标记细胞结果。PKH26③对细胞增殖、凋亡和周期的影响。PKH26④标记细胞的体外成骨成脂诱导分化情况。⑤标记细胞在子宫内膜的分布。

统计学分析：用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料用t 检验，结果以x _

±s 表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 BMSCs 形态观察及生长情况 原代细胞接种后24 h ，部分细胞贴附于瓶底，形态不规则，细胞边缘呈小锯齿状。72 h 后绝大部分细胞贴壁，呈短梭形、多角形，并有小集落形成。培养6~9 h 后，细胞生长融合成片，铺满瓶底的80%，可进行细胞的首次传代．经消化传代培养的细胞生长迅速，3~5 h 铺满瓶底的80%，形态趋于一致，多为长梭状，排列有序，见图1。

试剂

来源 DMEM-F12培养基、胰蛋白酶 胎牛血清

PKH26试剂盒

CCK-8

试剂盒

Hyclone 公司 Gibco 公司 Sigma 公司 同仁化学公司

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2.2 BMSCs 表面标志的测定 培养至第2代，99.86%的细胞CD29阳性，99.49%的细胞CD44阳性，而仅有2.16%的细胞CD34阴性，1.26%的细胞CD45阴性，证实为BMSCs ，见图2。

2.3 BMSCs 标记结果 PKH26染色的大鼠BMSCs 标记率达100%，染料在细胞膜上分布均匀，在倒置荧光显微镜下呈红色荧光，细胞轮廓清晰，见图3a 。继续培养24 h 后荧光显微镜下观察呈红色，见细胞贴壁、形态及生长状态良好，见图3b 。

2.4 BMSCs 标记组和未标记细胞增殖能力的检测 两组细胞各时间点的吸光值差异无显著性意义(P > 0.05)，

见图4。

2.5 BMSCs 标记组和未标记组的细胞凋亡检测 标记组与未标记组的细胞凋亡率分别(1.60±0.30)%，(1.41± 0.21)%，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 BMSCs 标记组和未标记组细胞的周期检测 大部分细胞处于静止期及DNA 合成前期(G 0~G 1期)，只有少数处于DNA 复制期(S 期)、DNA 合成后期及有丝期(G 2~M 期)。两组细胞各期的细胞比例差异无显著性意义(P > 0.05)。见表1。

2.7 成骨成脂诱导及鉴定 成骨诱导后3 d ，细胞逐渐变成短梭形，约10 d 形成结节样结构，诱导第14天茜素红染色为阳性，见图5a 。成脂诱导后3 d ，细胞回缩变为多角形，内可见小脂滴，诱导第14天油红O 染色可见细胞内脂肪滴染色呈阳性，见图5b 。

a: Labeled BMSCs without

adherence

Figure 1 Passage 2 bone marrow mesenchymal stem cells (×200)

图1 第2代大鼠骨髓间充质干细胞(×200)

Figure 2 Flow cytometry analysis of passage 2 bone marrow mesenchymal stem cells surface markers

图

2 第2代骨髓间充质干细胞表面标志流式细胞仪检测结果Figure

3 Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)

labeled with PKH26 (×200) 图3 PKH26标记骨髓间充质干细胞(×200)

b: Observation of labeled BMSCs after adherence for 24 h

Figure 4 Growth curves of labeled and unlabeled bone marrow mesenchymal stem cells

图4 标记组与未标记组细胞生长曲线的比较

0.80.70.60.50.40.30.2

M e a n

1

2

3

45

6

7

Time (d)

Absorbance value in labeled group (Mean) Absorbance value in unlabeled group (Mean)

a: Alizarin red staining

after osteogenic induction

Figure 5

Osteogenic and adipogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells and identification by PKH26 (×200) 图5 PKH26标记骨髓间充质干细胞的成骨成脂诱导及鉴定

(×200)

b: Oil red O staining after adipogenic induction

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2.8 BMSCs 移植后在大鼠子宫内膜组织中的分布 大鼠尾静脉移植BMSCs ，6周后荧光显微镜观察可见PKH26标记的BMSCs 呈红色荧光，可散在分布于子宫内膜的间质和腺上皮中，见图6。对照组子宫内膜未见红色荧光。

3 讨论

BMSCs 在组织工程中具有广阔的应用前景。间充质干细胞移植首先遇到的困难之一是如何标记移植细胞，示踪其存活、生长、分化等的过程[5-8]。目前已建立了较多的细胞标记技术，包括BrdU 标记、DAPI 标记、GFP 标记技术、Y 染色体标记、磁性标记技术等等。但是这些技术还存在一些问题。BrdU 的标记率不高且标记细胞凋亡或死亡后释放的BrdU 则可掺入处于细胞周期S 期的任何细胞，难以区分移植细胞和宿主细胞，假阳

性高[9]

。DAPI 标记时细胞会导致DAPI 淬灭，示踪时

间短。GFP 标记存在着转染效率不高以及转染后阳性克隆难以扩增

[10]

。Y 染色体标记检测试剂价格昂贵[11]

。磁

性标记技术对试剂和检测设备要求较高[12]。因此，需要寻找一种有效、稳定、实用的细胞标记技术示踪BMSCs 在体内的迁移情况。

PKH26是一种亲脂性荧光染料，与细胞膜发生不可逆性结合，对细胞进行荧光标记，其在551 nm 波长处可被激发红色荧光。随着细胞，标记物也随之等份的分配给子细胞。PKH26标记的细胞移植后不会从死亡或凋亡的细胞中释放出来，能够很好地区分移植细胞和宿主细胞，形成精确的荧光标记，在体内甚至有标记神经干细胞超过1年的记录[13]。目前广泛用于动物、植物细

胞和其他含颗粒胞膜的标记，细胞毒副作用不明显。本实验中PKH26标记不影响BMSCs 的细胞增殖、凋亡和细胞周期，仍保持其多分化潜能，成为研究干细胞迁移示踪的理想工具。移植后6周在子宫内膜组织可见PKH26标记的BMSCs 散在分布于间质和腺上皮，有效示踪BMSCs 在子宫内膜组织的迁移情况，为其在子宫内膜组织中的分化转归研究提供有效途径。相对于其他标记方法，PKH26标记效率高、细胞毒性小、不影响细胞生长特性和分化、荧光保存的时间比较长、标记和观察都方便易行，费用低廉且不会因为染料渗漏到周围细胞造成检测的假阳性。

综上所述，PKH26是BMSCs 有效的标记方法，稳定示踪在体内中的迁移情况，为研究BMSCs 在体内的分化转归等研究奠定基础。

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a:PKH26 labeled BMSCs

Figure 6 Distribution of PKH26 labeled bone marrow

mesenchymal stem cells (BMSCs) (arrow: red) in endometrium (×400) 图6 PKH26标记(箭头所示：红色)的骨髓间充质干细胞在子

宫内膜的分布(×400)

b: DAPI nuclear staining of BMSCs

c: Image synthesis