荧光光度分析法测定维生素B2的含量

引言

荧光分光光度法简介

有些物质，当用紫外光照射时，它吸收某种波长之后还会发射出各种颜色和强度不同的光；而当紫外光停止照射后，这种光线也随之消失，这种光线称为荧光。荧光的波长比吸收的紫外光波长要长。

由于物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同。利用物质的这个特性，可以对物质进行定性分析。同一种分子结构的物质，用同一种波长的紫外光照射，可发射相同波长的荧光；若该物质的浓度不同，所发射的荧光强度也不同，利用这个性质可以对物质进行定量分析。这种定量方法称为荧光分析法，简称荧光法。测量荧光的仪器有滤光片荧光计，滤光片—单色器荧光计和荧光分光光度计。荧光法的选择性好，灵敏度比紫外-可见分光光度法高2~3数量级，检出限低，可以达到10~12g／m1，线性范围宽。现在主要应用的是荧光分光光度计。

【实验目的】

1. 学习荧光光度法测定维生素B2的含量的基本原理和方法。

2. 熟悉荧光光度计的结构及使用方法。

【实验原理】

在经过紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。在稀溶液中，荧光强度IF 与物质的浓度c有以下关系：   

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：

这种以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，可提高荧光光度法的灵敏度。而吸收光度法，无论是提高激发光强度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法比吸收光度法灵敏度高。

VB2(即核黄素)在430～440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535nm。VB2的荧光强度在pH6～7时，在pH=11时基本消失。

维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：

VB2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2的荧光强度在pH=6～7时最强，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测定维生素B2的含量。

维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测定维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

【仪器与试剂】

1. 仪器

荧光光度计；容量瓶(50、1000mL)；吸量管(5mL)；棕色试剂瓶；洗瓶

2. 试剂

VB2对照品；市售VB2片；1％HAc溶液

【实验步骤】

1. 标准系列溶液的配制

(1) 10.0mg／L VB2标准溶液的配制

准确称取10.0mgVB2，将其溶解于少量的1％HAc溶液中，转移至1000mL容量瓶中，用1％HAc溶液稀释至刻度，摇匀。该溶液应装于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存。

(2) 标准系列溶液的配制

准确移取1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL和5.00mL的标准VB2溶液，分别加入5个干净的50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2. 待测样品液的配制

取市售VB2一片，用1％HAc溶液溶解，定容成1000mL，贮存于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存。

3. 标准溶液的测定

开启仪器，预热。用蒸馏水作空白，合上样品室盖，接通电源，调读数至“0”。用标准溶液中最浓的溶液，调节“满度”旋钮使其荧光读数为满刻度，用此作为荧光测量的基准；然后，从稀至浓的顺序分别测量系列标准溶液的荧光强度。

4. 未知试样的测定

取待测样品液2.50mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用与测定标准溶液相同的条件，测量待测样品液的荧光强度，平行测量其荧光强度3次。

【数据记录和结果处理】

1. 标准曲线绘制。

【注意事项】

1. 在测量荧光强度时，最好用同一个荧光皿，以避免由于荧光皿之间的差异而引起的测量误差。

2. 取荧光皿时，手指拿住棱角出，切不可碰光面，以免污染荧光皿，影响测量。

【思考题】

1. 荧光法对物质进行定性，定量的测定与紫外分光光度法的异同？

2.荧光法测定过程中应注意哪些问题?

3.试解释荧光光度法比吸收光度法灵敏度高的原因?