利用盐溶蛋白PAGE电泳法检测玉米种子的研究

基金项目:河北省自然科学基金资助项目(C20050001)

作者简介:葛荣朝(1974-),男,河北故城人,副教授,主要从事作物育种和分子细胞遗传学研究通讯作者:黄占景(1957-),男,河北深县人,教授,主要从事为植物分子生物学研究工作。

利用盐溶蛋白PAGE 电泳法检测玉米种子的研究

葛荣朝,赵宝存,李　薇,王莎莎,沈银柱,黄占景

(河北师范大学生命科学学院,河北石家庄　050016)

　　摘要:应用玉米盐溶蛋白PAGE 电泳方法检测了10个玉米品种的纯度及其杂交种的真实性。通过品种间的盐溶蛋白谱带的对比,发现其中有2条蛋白带是各品种所共有的,而除这些共有的蛋白带以外,各品种还具有一些特异条带。根据每个品种特有的蛋白条带,建立其特征条带图谱,可应用于该品种的相关鉴定工作。

关键词:玉米;盐溶蛋白;聚丙烯酰胺凝胶电泳

中图分类号:S338　　文献标识码:A 　　文章编号:1000-7091(2007)04-0091-03

Study on the Method of Detecting the Maize Seeds by Salt 2soluble Protein

PAGE E lectrophoresis

G E R ong 2chao ,ZH AO Bao 2cun ,LI W ei ,W ANG Sha 2sha ,SHE N Y in 2zhu ,H UANG Z han 2jing

(C ollege of Life Science ,Hebei N ormal University ,Shijiazhuang 　050016,China )

Abstract :The purity and authenticity of maize seeds of 10genotypes were detected with the method of the salt 2s olu 2ble protein PAGE electrophoresis.With the contrast of the PAGE patterns of salt 2s oluble protein on these 10varieties ,we can find the comm on patterns of maize and the peculiar patterns of every special variety.Then the standard patterns of va 2rieties can be established to identify a variety unknown.

K ey w ords :Maize ;Salt 2s oluble protein ;P olyacrylamide gel electrophoresis

　　目前,玉米在我国大范围种植,杂交种日益增多,而且一些杂交种以其产量高、品质好的特点受到

了人们的青睐。为了保证高产、稳产种子的真实性,杂交种纯度的检验就显得尤其重要。目前,国际上标准的权威鉴定法仍是田间种植法,但由于其试验周期长,试验成本高,而且有些杂交种间的农艺性状差异不大或没有差异,所以造成了这种传统方法的可行性逐渐降低。用蛋白质电泳鉴定种子的纯度和品种的真实性是近几年发展起来的一种新技术,方玉春等[1]通过田间种植法和蛋白质电泳法的比较证明了蛋白质PAGE 电泳法的准确性和可行性。盐溶蛋白PAGE 电泳法操作简便,快捷,可重复性强,短时间即可对玉米杂交种种子进行批量鉴定,是一种非常适合实际应用的鉴定方法[2,3]。

1　材料和方法

1.1　材料

由河北敦煌种业提供的玉米种子:金田62,金

田61,C3359,C20,J220父本,J220母本,J220,J T 6,J T 62,J205,J207,J216。1.2　试验试剂

1.2.1　电极缓冲液　甘氨酸1.50g ,于烧杯中加入450m L 去离子水溶解,用乳酸调至pH 3.3,再加去

离子水定容至500m L ,震荡混匀。1.2.2　样品提取液　氯化钠1.45g ,蔗糖50g ,甲基绿0.038g ,于烧杯中加去离子水200m L 溶解,加热至微沸,放至室温,再用去离子水定容至250m L ,在4℃条件下保存。1.2.3　分离胶缓冲液　取0.143m L 乳酸钠于烧杯中加去离子水90m L ,用乳酸调至pH 3.0,再加去离子水定容至100m L ,贮于棕色瓶中,在4℃条件下保存。1.2.4　分离胶溶液　溶液1:称取丙烯酰胺11.25g ,N ,N 2亚甲基双丙烯酰胺0.375g ,用50m L 分离胶缓冲液溶解,过滤于棕色瓶中,在4℃条件下保存。溶液2:取抗坏血酸0.025g ,硫酸亚铁0180mg ,用

50

华北农学报・2007,22(4):91293

1.2.5　浓缩胶缓冲液　取0.15m L乳酸钠于100 m L烧杯中,加去离子水40m L,用乳酸调至pH512,再加去离子水定容至50m L,贮于棕色瓶中,在4℃条件下保存。

1.2.6　浓缩胶溶液　溶液1:称取丙烯酰胺3.00g, N,N2亚甲基双丙烯酰胺0.50g,再用25m L浓缩胶缓冲液溶解,过滤于棕色瓶中,在4℃条件下保存。溶液2:取抗坏血酸0.015g,硫酸亚铁0.4mg,用25 m L浓缩胶缓冲液溶解,在4℃条件下保存(不超过6

d)。

1.2.7　染色液　称取考马斯亮蓝R2502.00g,在研钵中用100m L无水乙醇研磨溶解,过滤于棕色瓶中。取10m L该溶液,加入到200m L10%的三氯乙酸溶液中,混匀。

1.3　试验方法

从每一单交种送验样品中随机抽取玉米种子至少30粒,分别粉碎,放入115m L离心管中,用滴管加入与样品等体积的样品提取液,用振荡器摇匀,放置5min后,再摇一次,30min后,用离心机离心(5000r/min)15min,取上清液用于电泳。

取分离胶溶液的溶液1和溶液2各2m L,加入3%的过氧化氢溶液215μL,迅速摇匀,倒入胶室,高度距短玻璃板上沿1.5cm左右,轻轻震荡胶室使液面平整,待凝胶聚合后,用滤纸吸干分离胶表面上聚合出的水。然后取浓缩胶溶液的溶液1和溶液2各1m L,加入3%的过氧化氢溶液8μL,迅速摇匀,灌入胶室,插好样品梳。浓缩胶聚合后拔出样品梳,把胶室固定在垂直板电泳槽内,将上槽和下槽分别倒入电极缓冲液。用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液20μL。接通电源(上槽接正极,下槽接负极),先用100V稳压,当样品达到浓缩胶和分离胶的分界面时改用150V稳压进行电泳。直到指示剂下移至胶底部边缘时,关闭电源,取出胶板,置于考马斯亮蓝染色液中30℃恒温条件下染色2～4h。用自来水代替脱色液脱色约3h即可观察[4,5]。

2　结果与分析

2.1　品种纯度的检测结果

在对各杂交种盐溶蛋白检测试验中,混杂籽粒的盐溶蛋白在进行电泳检测时往往会出现与其他籽粒不同的蛋白条带。如C3359在被检测籽粒的盐溶蛋白电泳图谱中,个别籽粒出现一条R f=0.56的盐溶蛋白条带,而其他籽粒的蛋白带型基本一致,从而可以判断籽粒4应该属于混杂籽粒(图1)。在对各杂交种纯度检测后,最终确定金田62,金田61, C3359,C20,J220,J T6,J T62,J205,J207和J216的种子纯度分别为94.3%,96.0%,95.6%,92.4%, 92.9%,.3%,91.6%,87.3%,95.8%和78.1%

。

图1　C3359盐溶蛋白电泳谱带

Fig.1　The salt2soluble proteins PAGE results of C3359 2.2　单交种种子真实性的鉴定

杂交种籽粒的盐溶蛋白经PAGE电泳检测,其蛋白谱带一般会表现出与双亲一致的特征条带,所以根据杂交种与其双亲籽粒盐溶蛋白PAGE电泳检测结果,就可以初步判断出杂交种的种子真实性。如图2所示,杂交种J220及其亲本的电泳结果中R f=0.58的蛋白带是父本的特征带,R f=0.60的蛋白带是母本的特征带,而子代除籽粒7仅含有父本特征带,籽粒6仅含有母本特征带之外,其他籽粒均含有父母本的2条特征带,说明J220杂交种中籽粒3～5、8～10是真杂种,而籽粒6,7属于混杂的亲代种子

。

1.J220父本;

2.J220母本;3～10.J220

1.male parent of J220;

2.Femal parent of J220;3-10.J220

图2　J220及其亲本盐溶蛋白PAGE电泳谱带

Fig.2　The salt2soluble proteins PAGE results

of J220and its p arents

2.3　不同杂交种和品种间盐溶蛋白PAGE电泳谱带的比较

通过对各玉米杂交种和品种间的盐溶蛋白PAGE电泳结果比较,可以发现其主要的蛋白谱带表现出高度的一致,如图3中R f=0160和R f=0166的蛋白带是它们所共有的。而除这些共有的蛋白带以外,各供试材料还有一些自己特有的蛋白带,如果对特定品种进行重复电泳检测,即可建立起本品种特有的、稳定的蛋白特征谱带。根据杂交种父、母本的盐溶蛋白特征谱带,再结合杂交种本身是否具备这些特征谱带,就可以对其进行相关纯度和真伪性的检测

。

92　华　北　农　学　报22卷

1.金田61;

2.金田62;

3.J205;

4.J207;

5.J220;

6.J216;

7.C3359;

8.C20;9.JT6;10.JT62

1.Jintian61;

2.Jintian62;

3.J205;

4.J207;

5.J220;

6.J216;

7.C3359;

8.C20;9.JT6;10.JT62

图3　不同品种盐溶蛋白PAGE电泳谱带

Fig.3　The salt2soluble proteins PAGE results

of different varieties

3　讨论

在农作物品种及一些杂交种的检测中,大多选择具有一定技术基础的盐溶蛋白电泳、醋酸尿素蛋白电泳和酯酶同工酶电泳等方法。试验证明,盐溶蛋白质电泳方法具有数据离散程度最小,精确度高,有较高的重演性和适用性。另外,盐溶蛋白电泳方法的样品提取时间和电泳时间短,电泳谱带清晰,分辨率高,品种间谱带差异大,组合间互补带明显因此具有更强的可操作性[6]。

在玉米品种和杂交种的检测中,建立起各品种的特征谱带库,就可以作为其纯度检测的基本依据。玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为3个区域:α区、β区、γ区。其中β区由中等分子量蛋白质所组成,为主要谱带区域,在该区域中蛋白质谱带数量多,染色深,品种间差异大,为纯度鉴定中主要应用区;α区由小分子量蛋白质所组成,为次谱带区域,在该区域中蛋白质谱带数量少,谱带扩散,染色浅,品种间有差异,但不太显著。在纯度鉴定中,当β区域谱带差异不明显时可根据该区域的谱带差异进行鉴定;γ区域为高分子量蛋白质所组成,属于电泳谱带辅助区,该区域蛋白质谱带数量多,染色谱带细,不太容易观察,易受电泳条件的影响,最好不作为纯度鉴定的依据。如果β区和α区无差异,只有γ区有差异时,最好严格控制操作条件,以达到良好的重复性[7]。另外,在对大样本杂交种进行纯度检测时,应该注意随机取样,并加大样品量,以增加检测结果的代表性。

参考文献:

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-101

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4期葛荣朝等:利用盐溶蛋白PAGE电泳法检测玉米种子的研究93