大鼠皮肤创面愈合过程中IGF-1的定量学研究

198 CHINESE JOURNAL OF STEREOLOGY AND IMAGE ANALYSIS V ol.8 No.4 Dec.2003 文章编号：１００７－１４８２（２００３）０４－０５　

大鼠皮肤创面愈合过程中ＩＧＦ－１的定量学研究　

夏扬１，陈东明２，　周茂华３，　曲丛玲１，张建英１，高志敏１　

（１．　北京铁路总医院，北京　１０００３８；　２．北京大学第三医院，北京　１０００８３　；　

３．中国人民武装医学院附院，天津　３００１６２　）　

【摘要】目的：研究胰岛素样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－１）对大鼠皮肤创面愈合过程的影响。方法：以大鼠为动物模型，在伤后１ｄ、４ｄ、７ｄ、１１ｄ、１４ｄ、和１７ｄ取材，利用免疫组织化学和图像分析技术，研究皮肤创伤愈合过程中创面内源性ＩＧＦ－１、增殖细胞核内抗原（ＰＣＮＡ）及Ⅰ、Ⅲ型胶原的动态变化，以及与创面愈合相关因素成纤维细胞之间的关系。结果：在皮肤创伤愈合过程中，内源性ＩＧＦ－１表达量的变化与成纤维细胞活动、ＰＣＮＡ表达及Ⅰ型胶原的变化基本相符，与Ⅲ型胶原的变化关系不密切。结论：ＩＧＦ－１与成纤维细胞增殖、活跃程度密切相关，是影响创面愈合的重要因子之一。　　

【关键词】胰岛素样生长因子Ⅰ；创伤愈合　　

【中图分类号】R361.2 R392.3 【文献标识码】A

QUANTITATIVE STUDY ON IGF-1 DURING THE PROCESS OF

SKIN WOUND HEALING IN RATS

XIA Yang１,CHEN Dongming２,ZHOU Maohua３,QU Conglin１,ZHANG Jianying１,GAO Zhiming１

（1.　Beijing Railway General Hospital, Beijing 100038; 2. Third Hospital of Peking University, Beijing 100083;

3.The Hospital of Chinese Army Police Medical Collage, Tianjing 300162）

【ABSTRACT】Objective：To study the effect of Type I Insulin like growth factor ( IGF-1 ) in the process of wound healing in the back skin of rat. Methods：The wound models were made in the back skin of rat, then the specimens in the wound site were harvested after 1, 4, 7, 11, 14, 17days.

Immunohistochemistry(IHC) and Image analysis was employed to detect the change of regularity endogenous IGF-1 , Type Ⅰ，Ⅲ collagen and Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)in the process of wound healing. Research the relationship between them and their related factor of wound healing: fibroblast. Results：The changes of IGF-1 in wound mainly coincident to the changes of fibroblast, PCNA, but have not closely relation with the changes of TypeⅢ collagen in the process of wound healing in the skin of rats. Conclusion：IGF-1 is very important in the process of wound healing. IGF-1 have a closely relation with the proliferation of fibroblast. It is one of the main factors of adjusting the excretion of Type Ⅰcollagen in wound by fibroblast.

【KEYWORDS】IGF-1; Wound healing

在创伤修复过程中， IGF-1是参与组织修复的主要因子之一。既往的研究集中在IGF-1在全身的作用上。为了探讨创面局部组织中IGF-1与增殖细

胞核内抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的动态变化、以及它们与组织修复相关因素成纤维细胞和Ⅰ、Ⅲ型胶原间的关系，我们以大鼠背部切割伤为动物模型，进行了该实验研究。

1材料和方法2003年第8卷第4期夏扬等：大鼠皮肤创面愈合过程中IGF-1的定量学研究 199

1.1主要试剂

Ⅰ抗： IGF-1 、PCNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；Envision 购自基因公司，DAB购自中山公司。

1.2 动物模型的建立

清洁级SD大鼠20只（购于北京维通利华实验动物技术有限公司），体重180－200g。在大鼠背部脊柱切除直径1.6～1.8cm的圆形皮肤全层缺损，深达筋膜，每侧3个。创面压迫止血后暴露，不用任何药物，观察伤口的自然愈合过程。分别于伤后1、4、7、11、14、17d创面取材，伤后11～13d创面愈合后，14、17d取材为愈合部位组织，入10%固定10h，逐级脱水，作组织切片，采用HE 染色和免疫组化观察。自手术之日至取材结束，未见大鼠有感染等并发症，剃毛区被毛生长速度和光滑度未见异常。

1.3 HE染色：常规苏木素伊红染色。

1.4 免疫组织化学法（DAKO Envisions 二步法）

石蜡切片，组织切片厚度4μm，脱蜡至水；3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，孵育10 min；双蒸水 5min×3次室温；微波法抗原修复，pH6.0 枸盐酸缓冲液92℃-95℃ 10min；室温冷却10min，双蒸水 5min×3次，pH7.2 PBS浸泡5min；10%山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min；去血清，加入Ⅰ抗（IGF-1 1:200，PCNA 1:50， Type Ⅰcollagen 1:200， Type Ⅲcollagen 1:200）37℃，30min；pH7.2 PBS洗5min×3次；Envision孵育，37℃，30min；10、pH7.2 PBS洗5min×3次；0.05％DAB显色，苏木素复染后，脱水、透明、封片。免疫组化阴性对照以PBS代替Ⅰ抗，其它步骤维持不变，以确认试剂质量及控制染色效果。

1.5 结果判断

1.5.1 HE染色组织切片于光镜下观察成纤维细胞的生长情况。

1.5.2 IGF-1免疫组化的表达主要是在胞浆内，在细胞外的间质中也有出现（图1）。Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化的阳性信号在光镜下为棕黄色颗粒，胞浆和细胞间质表达（图2、图3）。阴性对照均未见有阳性表达（图4）。统一放大倍数为100倍，每张切片随机取5个视野，用真彩色病理图像分析系统（北京航空航天大学与空军总医院联合研制 CMIAS 2000）进行图像分析，积分光密度以任意单位au 表示(Intensity optical density，Arbitrary unit, IOD, au),代表阳性信号在组织中的相对含量。PCNA免疫组化阳性信号为棕黄色，主要在细胞核内表达（图5）。按PCNA标记指数（labelling index，LI）计算：观察1000个细胞，计数阳性细胞的百分数。

　图１　ＩＧＦ－１在胞浆内，在细胞外的间质中的表达，伤后　　　　　　　　图２　Ⅰ型胶原阳性信号在胞浆和细胞间质表达，伤后　第７ｄ　ＩＨＣ×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第７ｄＩＨＣ×１００　

　200 中国体视学与图像分析 2003年第8卷第4期

图３　Ⅲ型胶原阳性信号在胞浆和细胞间质表达，伤后第７ｄ　　　　　　图４免疫组化的阴性对照均未见有阳性表达，伤后第７ｄ　　ＩＨＣ×１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＨＣ×１００　

图５　　ＰＣＮＡ阳性信号主要在细胞核内表达，伤后第７ｄ　　　ＩＨＣ×１００　

１．６统计学处理：　

所有资料用SPSS for Windows 10.0软件包进行t检验显著性分析。

2 结果

2.1创面大体观察

在大鼠皮肤创面自然愈合过程中，伤后4d 时，创面有轻度回缩，上皮化不明显，创面干燥，在血痂下有新鲜肉芽组织，色泽较红，有轻度水肿。伤后7d，创面周围明显上皮化，面积明显缩小，创面表面干痂易于去除，痂下肉芽新鲜，呈颗粒状，有些创面可见有皮岛扩展，创缘新皮较薄，透明。伤后11d时，创面明显缩小，上皮化明显，上皮薄，所剩创面不规则，创面鲜红，易出血。创面一般在伤后12d到14d完全愈合，17d时可见创面表面有上皮覆盖，上皮表面有稀疏的细绒毛，愈合部位比正常皮肤处稍凹陷。

2.2组织学分析

在正常组织中，成纤维细胞数不多，细胞间有胶原纤维存在，排列的方向性不明显。伤后1d，创面周围的正常皮肤中开始出现成纤维细胞，创面中主要是炎细胞浸润。伤后4d，在伤口内出现有较多的成纤维细胞和内皮细胞，并有新生毛细血管的形成。伤后7d，伤口内成纤维细胞和内皮细胞大量增殖，毛细血管增多，细胞代谢最旺盛，增殖最为明显。伤后11d，创面明显缩小后，活跃的成纤维细胞数目减少，组织细胞反应性下降。伤后14d到17d，创面愈合，几乎没有活跃的成纤维细胞存在，细胞间有大量的胶原，排列有序。

2.3免疫组化结果

从表1中可以看出，在正常的皮肤中IGF-1的表达为阴性。伤后1d，在有刺激因素的存在下，组织中开始出现IGF-1的表达，说明在组织中出现了内源性的IGF-1。伤后4d到11d，创面中IGF-1的表达逐步升高，在伤后7d达到峰值后就随创面愈合过程的完成开始减少。在伤后14天和17天创面完全愈合后取材的标本可以看出，组织修复完成后，组织中IGF-1的表达量虽然降低，但仍可见有表达。

2003年第8卷第4期夏扬等：大鼠皮肤创面愈合过程中IGF-1的定量学研究 201

表１　ＩＧＦ－１、Ⅰ、Ⅲ型胶原和ＰＣＮＡ图像分析结果（x±ＳＤ）　

积分光密度（au）

时间（天）

IGF-1 Ⅰ型胶原Ⅲ型胶原

PCNA(%)

0 0 125.03±17.72 114.32±15.62 1.60±1.10

1 108.±62.36 2.55±34.59** 367.14±32.50** 6.45±3.20

4 319.06±91.56 453.61±70.40** 517.46±43.51** 22.51±9.98

7 395.49±85. 623.47±82.51** 547.79±54.88** 50.22±18.23*

11 327.73±69.76 631.76±78.87** 551.67±53.91** 42.31±14.09*

14 288.86±66.13 627.37±84.85** 554.75±62.85** 22.79±11.33

17 119.35±54.44 616.43±77.57** 553.81±59.67** 9.01±4.66

注：与同组第０天相比：＊Ｐ＜０．０５；　＊＊Ｐ＜０．０１。　

在伤后1d，Ⅰ、Ⅲ型胶原在胞浆的表达呈阳性。以Ⅲ型胶原的增加较为明显，在伤后4d，Ⅰ型胶原的表达量上升，Ⅲ型胶原的升高较第1d的增加量为少。至伤后7天Ⅰ型胶原的表达量达到峰值。此时的表达已经比Ⅲ型胶原的表达量高。伤后11天，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达量也就不再增加。在伤后14天和17天创面完全愈合后取材的标本可以看出，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达量维持不变。与正常皮肤相比，伤后Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量P＜0.01，有显著性差异存在。

可以看出，在正常皮肤组织中，细胞核内PCNA的表达极低。伤后1dPCNA开始出现， 7d 达到峰值，在伤后11d，随着创面的明显缩小，核内PCNA的表达量开始下降。同正常皮肤相比，7d 和11d细胞核内PCNA的表达量p＜0.05，具有显著性差异。愈合后的14d、17d，活跃的成纤维细胞数目减少，细胞核内PCNA的表达量也就进一步地降低，但仍存在着一定数量的表达。此时，与正常皮肤相比已无显著性差异。

3 讨论

现代创伤修复的概念为：创伤修复是多种细胞、生长因子和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间相互作用的过程，是一个复杂的动态过程，而生长因子在整个修复过程中起着极为重要的作用。

成纤维细胞（fibroblast,FB）是主要的修复细胞［1］，IGF-1是成纤维细胞进入细胞周期的促进因子［2］。它的作用是在G0/G1期后的6h促进细胞由细胞的点（R点）进入S期，并刺激细胞的分化及合成［3］。用IGF-1受体单克隆抗体阻断实验证明IGF对DNA的合成刺激作用由IGF-1受体所介导［4］。

PCNA是一种在增殖细胞核内的DNA多聚酶polδ的辅助因子，与真核细胞S期的DNA的复制有关［5］。PCNA的出现与细胞的增殖有关，在静止的细胞，很少有PCNA的出现，在细胞周期中，G1晚期量开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降［6］。用免疫组化方法可显示出细胞的PCNA 标记反应，用于估计细胞或组织的增殖活性［7］。

皮肤伤口愈合程度直接取决于跨越沉积到伤口边缘处的胶原合成量。成纤维细胞所产生的Ⅰ、Ⅲ型胶原是主要的间质胶原，也是皮肤结缔组织中的主要胶原类型。它不仅能填充组织缺损，同时还为表皮细胞迁移提供支架。所以创面中成纤维细胞是否增生活跃直接影响着创面的愈合时间。

可以看出：IGF-1表达的变化趋势、PCNA表达的变化趋势和Ⅰ型胶原增加量的变化趋势相一致，在正常情况下很少有组织细胞进入周期，主要是保持在静止的状态。PCNA的表达和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达较低。在外伤这个刺激因素的作用下，成纤维细胞开始增殖，出现了PCNA和IGF-1的表达，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达方面，Ⅲ型胶原的表达量较Ⅰ型胶原多，这与创伤修复过程早期以Ⅲ型胶原合成为主相一致。伤后第7d，IGF-1和PCNA 的表达的表达均达到峰值，说明此时进入细胞周期的成纤维细胞量最多，增殖活性最强，这与组织学上的观察相吻合。随着创面的愈合，IGF-1的表达下降，PCNA的表达也就相应地降低。说明了IGF-1的变化和PCNA的变化有内在的联系。

组织愈合后，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达量在高值不变的原因可能是：创面中胶原的降解是在胶原酶的作用下进行的，不可能在创面愈合后就立即完成，而是在愈合后较长一段时间内逐步改建完成的。

202 中国体视学与图像分析 2003年第8卷第4期

综上所述，我们可以看出，伤口内IGF-1表达量的变化与成纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的变化相关，与Ⅲ型胶原的表达关系不密切。IGF-1表达的高峰期也是成纤维细胞生长、增殖、基质合成，Ⅰ型胶原表达的高峰期。在创面完全愈合后IGF-1表达水平明显下降，Ⅰ型胶原的表达也就没有再增加。与Ⅲ型胶原的表达关系不密切。所以说，IGF-1可能是伤口微环境中参与Ⅰ型胶原合成的重要介质之一，和创面的愈合有固有的内在联系，在创面的愈合过程中并发挥了特殊的作用。

参考文献

[1] Lekic P, McCulloch CA. Periodontal ligament cell population: the

central role of fibroblasts in creating a unique tissue. Anat Rec. 1996 Jun; 245(2): 327-41

[2] Y u W, Naim JO, Lanzafame RJ. Expression of growth factors in early

wound healing in rat skin. Lasers Surg Med. 1994; 15(3): 281-9

[3] 周廷冲，马贤凯，唐佩弦，等.胰岛素样生长因子。周廷冲，主编.

多肽生长因子基础与临床。第一版.北京：中国科学技术出版社，1992，42－52

[4] Huang KF, Chung DH, Herndon DN. Insulin like growth factor 1

(IGF-1) reduces gut atrophy and bacterial translocation after severe burn injury. Arch Surg. 1993 Jan; 128(1):47-53

[5] Keiman Z. PCNA: structure, function and interaction. Oncogene

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[6] Bravo R, Frank R, Blundell PA, et al. Cyclin/PCNA is the auxiliary

protein of DNA polymerase-delta. Nature. 1987 Apr 2-8; 326(6112): 515-7

[7] Moller N, Jorgensen JO, Alberti KG, et al. Short-term effects of

growth hormone on fuel oxidation and regional substrate metabolism in normal man. J Clin Endocrinol Metab. 1990 Apr; 70(4): 1179-86

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・动态与简讯・

第１１届国际体视学大会北京会议　

暨第１０届中国体视学与图像分析学术会议在京举行

经国际体视学会和中国科学技术协会批准，第11届国际体视学大会北京会议暨第10届中国体视学与图像分析学术会议，于2003年11月4-6日在北京召开。出席大会的代表分别来自美国、法国、德国、荷兰、斯洛文尼亚、澳大利亚和中国，共117名。其中国际体视学学会上届Hans Eckart EXNER教授、下届Dominique JEULIN教授、本届秘书长Nigel WREFORD教授、国际图像分析和体视学杂志主编Ida ERZEN教授，清华大学校长顾秉林院士莅临会议，中国科协国际部和国家自然科学基金委材料与工程学部派代表参加了开幕式。

本届学术会议共收到学术论文147篇，其中英文论文78篇，中文论文69篇；安排大会特邀专题报告16篇，论文口头报告48篇。内容涉及体视学和图像分析新技术、生物医学、材料科学、仿真与虚拟现实、CT理论与应用及金像与显微分析等领域。论文特点是：（1）论文质量和水平明显提高，特别是专题报告中所介绍的上述领域新进展受到与会代表的好评；（2）新技术、新方法、新概念、新参数、新公式的论文数量明显较前三届学术会议增多；（3）中青年学者和科技工作者的论文数量明显增多。通过全体与会代表无记名投票，评选出5篇优秀学术论文，并向作者颁发了证书。会议编辑出版了论文集。另外，经同行评审合格的英文和中文论文正在国际体视学学会会刊《Image Analysis and Stereology》及中国体视学学会会刊《中国体视学与图像分析》上陆续发表。

本届学术会议论文的内容和水平，出色的组织及与会代表的积极参与，受到国外学者的高度评价，特别是国际体视学学会的主要负责人明确表示了2007年第十二届国际体视学大会在中国召开的倾向性意见，我国的与会代表表示将以新的研究成果在下届国际体视学大会上进一步展示。

（王德文刘国权）