生物化学实验的基本操作

（一）玻璃仪器的洗涤及干燥

1、一般仪器：烧杯、试管、离心管等普通玻璃仪器，可直接用毛刷蘸餐洗净刷洗，然后用自来水冲洗，直至容器内不挂水珠即可。最后用少量蒸馏水冲洗内壁2－3次，倒置晾干即可。

2、容量分析仪器：容量瓶、滴定管及吸管等容量仪器，用后用自来水多次冲洗，如能清洁（壁不挂水珠），再用蒸馏水少量冲洗2~3次晾干即可备用。若仍不干净附有油污等，则须于干后放入铬酸洗液内浸泡数小时，然后倒净（或捞出）洗液，用自来水充分冲洗至水不显黄色后再冲几次，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次晾干备用。

在做酶学实验时，对仪器的清洁要求更高，因如有极微量的污物（如重金属离子）即可导致整个实验失败。因此，必要时仪器经上述方法洗涤后，还需用稀盐酸或稀洗涤，以除去铬及其它金属离子，然后再用自来水、蒸馏水冲洗。生化实验室常用的洗液有以下几种：

（1）铬酸洗液：为最常用的洗液，由重铬酸钾、粗硫酸及水配制而成，去污力强，清洗效果好。其配制方法有多种，可根据需要进行选择，常用的配方如下表。

（2）10%尿素液：为蛋白质良好溶剂，帮适用于洗涤盛血的容器。

（3）草酸盐液：用于清洗过锰酸钾的痕迹。

（4）液：用1：1的水溶液，用于清洗CO2测定器及微量滴定管。

（5）乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Nａ2）液：5~10%的EDTA－Nａ2液可用于洗涤器皿内无机盐类。

玻璃仪器的干燥方法可根据不同仪器的种类而定。一般地说洗净后的玻璃仪器，如不急用应倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中烤干，但容量玻璃仪器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及烧结、结构复杂的玻璃仪器等，严禁烘烤。此类仪器，如急用可采用水泵抽气法干燥。

（二）常用玻璃仪器的使用

1、吸量管：吸量管是用来测量一定容积的液体，并把它从一个器皿转移至另一个器皿中的量器。常用的吸量管有以下几种：

（1）刻度吸量管：刻度吸量管是多刻度吸量管，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等规格。吸量管刻度所标的数字有自上而下和自下而上两种，使用之前应仔细分辨。实验室所用之刻度吸管多属于刻度到尖端的吸管，所以要吹出尖端留存的液体。

（2）奥氏吸管：在量取粘度较大的液体如血液、血清等时，应当使用奥氏吸管。这种吸管也是单标的，并且在其下端有一个膨大部分。所以液体与吸管表面接触面积较小，当量取血液时，较他种吸管准确。奥氏吸管的容量包括遗留在尖端的液体，故在缓缓使液体流出后，再停留数秒钟，吹出最后一滴。在学生实验中常用的有1、2、5毫升等规格。

吸量管使用法：使用吸量管时，用拇指和中指靠近顶端部分。将管的下端插入液体里，用吸球吸入液体至需要刻度的标线上1~2厘米处（插入液面下的部分不可太深，以免管的外壁沾附的溶液太多；也不可太浅，防止空气突然进入管内，将溶液吸入吸球内），将已充满液体的吸量管提出液面，用小片滤纸揩去管外沾附的溶液，把吸管提到与眼睛在同一水平线上。然后小心松开上口，按所需要液体容积缓缓自由流出。最后再根据规定吹出或者不吹出尖端的一滴。

（3）微量加样器

2、容量瓶及量筒：容量瓶是一个细长颈梨形的平底瓶，具有磨口塞，颈上有标线，表示在所示温度下（一般为20℃）当液体充满到标线时，液体体积恰好与瓶下所注明的体积相等。容量瓶有10、25、50、100、200、250、500、1000、2000毫升等规格。

容量瓶是装量型的定量容器，多用作稀释溶液或配制精确试剂。当将液体加至刻度后须用瓶塞塞好，颠倒混匀数次方可使用。

容量瓶是较精确的定量容器，不得直接加热或烘烤，也不应将盛有溶液的容量瓶放入冰箱内。当配制溶液需要加热促其溶解时，必须在烧杯中加热溶解，并待溶液达到室温后，再定量地转入容量瓶内，然后稀释到刻度，并要注意摇匀。

当所量取的液体量要求不十分准确时，可使用量筒，因其较使用吸管或量瓶更为简便，量筒之底座及筒身是焊接一起的，因而不能　量取过热液体，更不能直接加热，以防炸裂。

3、滴定管：滴定管是供容量分析滴定之用，有带玻塞及橡皮管的两种类型。前者用以量酸，后者用以量碱。

滴定管有刻度较精细的微量滴定管，有1.0、2.0、5.0、10毫升等规格。还有25、50、100毫升等规格的常量滴定管。使用滴定管应该注意以下事项：

（1）检查是否清洁干燥，是否漏水，玻塞是否滑润，如有漏水或转动不灵，应拆下活塞重新涂抹凡士林。涂抹前要将玻塞擦干，用手指沾少量凡士林在活塞两头各擦一薄层，将活塞插入槽内，然后向同一方向转动活塞，直到从外面看时，全部透明为止。油涂好后，在活塞的小头的槽上套一橡皮圈，以防活塞滑脱。

（2）使用前必须认出每一格表示多少毫升。先用少量滴定液清洗滴定管2~3次，然后方可装液。装液体后，管内如有气泡必须排出。

（3）滴定前先应读取起始点。滴定时，左手控制玻塞，右手持瓶，边滴边摇，密切注意被滴定溶液的颜色变化。

（4）装置滴定管时，管身必须与地面垂直。读数时眼睛与溶液月形面下缘在同一水平线上，不要仰头或低头读数。

（5）如用酸式滴定管装碱性溶液，滴定后应立即洗净，以免活塞粘连。

二、一般操作技术

1、混匀法：欲使一化学反应充分进行，必须使反应体系内各种物质迅速地相互接触，因此除特别规定外，一般都需要将反应物彻底混匀。混匀方式大致有以下几种，可随使用的器皿的液体容量而选用。

（1）旋转混匀法：手持容器作离心旋转，适用以未盛满液体的试管或小口器皿，如三角瓶等。

（2）弹指混匀法：左手持试管使直立，以右手食指轻击试管下部，使管内溶液作旋转流动。

（3）倒转混匀法：适用于有玻璃塞的瓶子，如容量瓶等。

（4）弹动混匀法：以右手大拇指、食指、中指握住试管上部，将试管放平，于左手掌中弹动。

（5）吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸放数次，适用于量少而无沉淀的液体。

（6）搅拌混匀法：适应烧杯等大口容器所盛之溶液的混匀，一般在配制混合试剂时，用玻棒搅拌以助溶，或混匀大量的溶液。

2、保温与加热：为使某一化学反应在一定的温度下进行，常需要保温；为促进或停止化学反应，有时需要加热。

（1）保温：常用恒温箱或恒温水浴进行，后者的温度较前者稳定。

（2）加热：加热常用两种方法，一是直接把试管、烧杯等器皿在酒精灯、电炉或煤气火焰上加热；二是在水浴中加热或煮沸，应根据实验的目的而定。

3、过滤：过滤的目的是将沉淀与液体分开，可用滤纸、棉花、纱布等。生化实验中所进行的过滤，为了不改变溶液的浓度，一般不要用水湿润滤纸。过滤所用的滤纸常摺成多摺状，以增大过滤面积。当过滤难滤之物或为了加快速度，可采用减压抽滤法。实验室中有时用离心法代替过滤。

三、实验样品的制备

在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，还是研究组织中物质代谢的过程，皆需利用特定的生物样品。为了达到一定的实验目的，往往需要将获得的样品预先做适当的处理。掌握实验样品的正确处理方法乃是做好生物化学实验的先决条件。

基础生物化学实验中，最常用的动物或人体样品是全血、血清、血浆及无蛋白血滤液。组织样品则常用肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等，实验时可制成组织匀浆、组织糜、组织切片或组织浸出液等形式。有关这些组织样品的制备方法，扼要介绍如下：

（一）血液样品

全血：无论是收集动物还是人的血液，均应注意仪器的清洁与干燥，同时也要及时加入适当的抗凝剂以防止血液的凝固。一般在血液取出后，迅速盛于含有抗凝剂的器皿中，同时轻轻摇动，使血液与抗凝剂充分混合，以免形成小凝块。取得全血如不立即进行实验，应储存于冰箱内。

常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠及肝素等，可视实验要求而选用。一般实验用草酸盐即可，但它不适用于血钙测定。氟化钠因兼有抗凝及抑制糖酵解之作用，故可用于血糖测定。但因其也能抑制脲酶，故用脲酶测定尿素时，则不能应用。肝素虽好，但价格较贵。

抗凝剂的用量不应过多，否则影响实验结果。通常每毫升血液加1~2mg草酸盐或5mg柠檬酸钠或5~10mg氟化钠，肝素仅需要0.01~0.2mg，最好抗凝剂制成适当浓度的水溶液，然后取0.5ml置于准备盛血的器皿内，再横放蒸干（肝素不宜超过30℃），则抗凝剂在器皿壁上形成一层薄膜，使用时较为方便，效果较满意。

血浆：上述抗凝的全血在离心机中离心，所得的上清液即为血浆。如需用血浆进行分析时，必须严格防止溶血，故采血时一切用具（注射器、针头、试管等）皆需清洁干燥，取出的血液也不能剧烈振摇。

血清：收集的血液不加抗凝剂，在室温下放5~20分钟即自行凝固。通常经3小时，血块收缩，析出清亮的血清。为了节省时间，必要时可离心分离血清。制备血清同样须防止溶血。

无蛋白血滤液：分析血液中许多成分时，也常除去蛋白质，制成无蛋白血滤液。如血液中的非蛋白氮、尿酸、肌酸等测定皆需先把血液制成无蛋白血滤液后，再进行分析测定。蛋白质沉淀剂如钨酸、三氯醋酸或氢氧化锌皆可用于制备无蛋白血滤液，可根据不同的需要而加以选择。

（二）尿液样品

一般定性实验只需将尿收集一次即可，但一天之中各次排出尿液的成分随食物、饮水及一昼夜的内生理变化等的影响而有很大的差异，因此定量测定尿液中各种成分皆应收集24小时尿混合后取样。通常在早晨一定时间排出残余尿而弃去，以后每次尿皆收集于清洁大玻瓶中，到第二天早晨同一时间收集最后一次尿即可，随即混合并用量筒量准其体积。

收集的尿液如不能立即进行实验，则应置于冷处保存。必要时可在收集尿时即于收集的玻瓶中加入防腐剂如甲苯、盐酸等，通常每升尿中约加入5ml甲苯或5ml盐酸即可。

如须收集动物尿液，可将动物置于代谢笼中，其排出之尿液经笼下漏斗流入瓶中而收集之。

（三）组织样品

离体不久的组织，在适宜的温度及ｐH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织，研究各种物质代谢的途径与酶系的作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。

但是各种组织离体过久后，都要发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后发生变性而失活。有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟内，其含量即有明显的降低，因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需之脏器或组织，去除外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷之生理盐水洗去血液，必要时也可用冰冷之生理盐水灌注脏器以洗去血液，再用滤纸吸干，即可作实验之用。取出的脏器或组织，可根据不同的目的，用以下不同的方法制成不同的组织样品。

组织糜：将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机绞成糜状即可。

组织匀浆：新鲜组织称取重量后剪碎，加入适当的匀浆制备液，用高速电动匀浆器将组织研磨成匀浆。为了降低研磨产生的热量，使组织及酶不致变性，制备匀浆时一般应将玻璃匀浆管插入冰水浴中，适当控制研磨的速度。

玻璃匀浆管是一种特制的厚壁毛玻璃管和一个一端带有磨砂玻璃杵头的研磨杆组成。规格大小不一，使用时可根据需要进行选择。