猪新基因NPM1的克隆_序列分析与染色体定位

A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica

猪新基因N PM 1的克隆、序列分析与染色体定位

唐中林1,2,李　勇1,赵书红1,刘　榜1,樊　斌1,朱猛进1,李　奎1,23

(1.华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,武汉430070;

2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100094)

摘　要:克隆了猪N PM 1基因的cDNA 和第4内含子序列,并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA 序列全长1195bp 且包含一个完整的开放阅读框,编码294个氨基酸。内含子序列长300bp ,遵循GT/A G 剪接法则。序列分析表明,该基因与已报道的人、大鼠和小鼠等物种的N PM 1基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为95%、

91%和91%。该基因编码的蛋白具有Nucleoplasmin 保守功能域。用体细胞杂种板将该基因定位在猪16号染色

体q21区段,辐射杂种板定位结果表明该基因与猪16号染色体上SW977标记紧密连锁。关键词:猪;N PM 1基因;克隆;序列分析;染色体定位

中图分类号:S82812　　　　文献标识码:A 　　　　文章编号:0366269(2007)022*******

收稿日期:2006203202

基金项目:国家自然科学基金重点项目资助(30330440)

作者简介:唐中林(19742),男,湖南衡阳人,博士,主要从事动物分子生物学研究,Email :zhonglinqy_99@sina.com.cn 3通讯作者:李　奎,博士,教授,主要从事动物遗传育种与繁殖研究,Email :likuihau @yahoo.com

Cloning ,Sequence Analysis and Chromosome Mapping of Porcine N e w N PM 1G ene

TAN G Zhong 2lin 1,2,L I Y ong 1,ZHAO Shu 2hong 1,L IU Bang 1,

FAN Bin 1,ZHU Meng 2jin 1,L I Kui 1,23

(1.Key L aboratory of A gricultural A nimal Heredity ,B reeding and Reproduction ,Ministry of Ed ucation ,H uaz hong A g ricult ural Universit y ,W uhan 430070,Chi na;2.I nstit ute of A ni m al

S cience ,Chi nese A cadem y of A g ricult ural S ciences ,B ei j i ng 100094,Chi na )

Abstract :The cDNA and fourt h int ron sequences of porcine N PM 1gene were cloned ,and veri 2fied by bioinformatics met hod.The cDNA f ragment was 1195bp wit h an entire open reading frame (ORF ),encoding 294amino acids.The int ron f ragment was 300bp and splice junctions follow ‘GT/A G ’rule.The analysis of sequence revealed t hat t he porcine N PM 1gene was highly homologous wit h t hat of ot her species such as human (95%),mouse (91%)and ratt us norvegi 2

cus (91%)in amino acid.The p rotein encoded by porcine N PM 1gene had a conserved domain

‘Nucleoplasmin ’.This gene was assigned to SSC16q21region and closely linked to SW977wit h t he LOD of 9.16by SCH P and IMp R H mapping ,respectively.

K ey w ords :porcine ;N PM 1gene ;clone ;sequence analysis ;chromo some mapping 　　N PM 1(Nucleolar p ho sp hoprotein B23,numat rin )基因别名又称B23,编码一种多功能的核质穿梭蛋白[1],它具有细胞增殖负作用[2,3],大量研究表明它参与抗凋亡、细胞老化、中心体周期、细胞内蛋白转运、核质转运、核糖体组装和信号转导等多种生物学过程[4～9]。近年来已经成为肿瘤发生研究中的热点,尤其是在急性骨髓白血病研究

中[10～12]。Grisendi 等[13]报道,该基因对胚胎发育和

维持基因组稳定具有重要作用。

N PM 1基因被定位于人5号染色体的q35区段,由10个外显子和9个内含子构成,由于选择性剪接在转录中产生3个大小片段不同的变异体。变异体1的mRNA 全长1373bp ,编码294个氨基酸,变异体2的mRNA 全长1286bp ,编码265个

氨基酸,变异体3的mRNA全长1274bp,编码259个氨基酸。该基因在E2bo x和侧翼区具有高度的保守性[14],其编码的蛋白存在一个Nucleoplasmin 保守性结构域。此外,目前仅在小鼠[15]、大鼠[16]、鸡[17]、斑马鱼等5个物种克隆到该基因的cDNA序列。

该基因在人类研究相对深入,主要集中在肿瘤发生的研究中,并在许多血液病中发现该基因的突变和重排现象。N PM1基因编码蛋白的C2末端突变在急性骨髓白血病高频发生,其可能作为该疾病研究的诊断与治疗用候选基因[12]。在近两年来,该基因的研究已经成为热点。

中外猪种在产肉性状方面存在很大差异,产肉量的多少取决于骨骼肌肉的生长,而骨骼肌生成包括肌纤维数目的增加和体积的肥大。研究表明,中外猪种间肌纤维数目的多少存在显著差异,而肌纤维横截面积大小差异不显著。肌纤维的数目增加主要发生在出生前,在妊娠75d时肌纤维数目基本恒定。为此,我们利用LongSA GE技术开展了中外猪种不同发育时期胚胎骨骼肌全基因组转录谱研究,发现一个与人、鼠N PM1基因序列高度同源的标签在骨骼肌发育过程中差异表达,并在中外猪种间早期的胚胎骨骼肌中差异表达。基于此,本研究根据人、鼠等物种N PM1基因的序列信息,对猪N PM1基因进行克隆、定位,并在所获序列基础上进行相关的生物信息学分析,旨在为开展产肉性状分子遗传基础研究积累素材。

1　材料与方法

111　D NA与RNA

从猪血液中提取DNA保存于4℃。快速分离通城猪胚胎骨骼肌组织样,置于液氮中速冻并于-80℃保存备用。取100mg组织样匀浆后用T rizol (Invitrogen)法提取总RNA于-80℃保存备用。112　引物设计与合成

以人N PM1基因的mRNA序列为种子序列在NCB I中搜索猪的EST序列,将同源性大于85%的猪EST序列下载到本地计算机,然后用DNAstar 软件包Seqman程序对序列进行拼接,得到一条长为1324bp带polyA尾的contig。然后以此contig 序列为依据,并结合GenBank发表的人、鼠、小鼠等物种的N PM1基因mRNA同源性,用Primer5.0设计cDNA、第4内含子序列克隆和基因定位引物

各1对,引物由上海华诺生物技术公司合成。引物信息如下:

cDNA序列克隆引物:

F1:5′A T TA TCTCC GTCCGCC T TC T3′,

R1:5′CCA T T T GTC T GACCACCACTAC3′。

内含子序列克隆引物:

F2:5′ACC T GT GGTC T TAC GGT T GA3′,

R2:5′GGCA GAAC GC T T TCCA GA3′。

定位引物:

F3:5′GT GA GAAC T T TCCCTACCGT G3′,

R3:5′CCA T T T GTC T GACCACCACTAC3′。

1.3　cD NA和第4内含子序列PCR扩增

按大连宝生物反转录试剂盒(RNA PCR K it)要求进行反转录。反转录反应体系为:2μL10×RNA PCR buffer,4μL MgCl225mmol/L,2μL dN TP Mixt ure,0.5μL RNase inhibitor(40 U/μL),1μL AMV Reverse Transcriptase(5 U/μL),1μL Oligo(d T)Primer,1μL RNA sam2 ple,8.5μL RNase Free H2O,总体系为20μL。反转录条件为:70℃5min,42℃30min,95℃5 min,5℃5min,1个循环。

以猪血液DNA和骨骼肌RNA反转录物为模板进行第4内含子和cDNA序列扩增,其PCR反应体系为:2.5μL10×PCR buffer,2μL dN TP Mix2 t ure,0.2μL T aq酶(5U/μL),正反向引物各1μL,DNA或cDNA模板2μL,用d H2O将体系调整为20μL。PCR扩增条件为:94℃预变性4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min;扩增35个循环; 72℃延伸5min,4℃保存。

1.4　克隆和测序

将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳,用上海华舜小量胶回收试剂盒回收目的片段,将回收片段同T载体(p MD-18T,Ta KaRa)连接并转化D H5a感受态细胞,挑取阳性克隆菌落进行摇菌,然后进行菌液PCR鉴定。送阳性克隆到上海华诺生物技术有限公司测序。

1.5　序列分析和结构预测

将克隆到的cDNA序列在NCB I网上用ORF Finder程序对获得的序列进行开放阅读框预测。另外,将获得的序列在GenBank数据库进行BL AST初步的比较分析,并将相关物种N PM1基因序列下载,在DNAstar软件上进行同源比对,并用Cluster W算法进行聚类分析得到系统发生树。

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　2期唐中林等:猪新基因N PM 1的克隆、序列分析与染色体定位

在NCB I 的CDD 数据库中运用生物学软件RPS 2blast 程序分析蛋白质的保守结构域。1.6　体细胞(SCHP)和辐射杂种板(IMpRH)基因定位

PCR 反应体系为10μL ,其中1μL 模板DNA ,2.0μL 10×PCR buffer ,0.5μL dN TP Mixt ure ,0.2μL T aq 酶(5U/μL ),正反向引物各0.2μL ,用d H 2O 将体系调整为10μL 。PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,对PCR 结果进行判型。在SC HP 中,“+”表示扩增结果阳性,“-”表示扩增结

果阴性,“?”表示扩增结果不确定。在IMp R H 中,“1”表示扩增结果阳性,“0”表示扩增结果阴性,“?”表示扩增结果不确定。将PCR 分型结果分别提交到HybWeb (http ://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.ht 2ml )和ImpRH 网(http ://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc/pig/RH )进行统计分析获得定位结果。2　结　果

2.1　cD NA 和第4内含子序列扩增

在2%的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR 产物(见

图1)。电泳检测结果表明,R T 2PCR 扩增得到的产物片段大小与预期长度相符,初步分析产物为目的带。以基因组DNA 为模板扩增第4内含子,得到大小为500bp 左右的目的带。2.2　内含子和cD NA 序列

经克隆测序,第4号内含子序列PCR 扩增产物大小为445bp ,以GT/A G 方式发生剪接,其中内含子序列为300bp 。R T 2PCR 得到长度为1195bp 的cDNA 序列,运用NCB I 上生物学软件ORF Finder 程序进行分析,发现所得cDNA 序列的50～934位存在一个完整开放阅读框,长885bp ,

编码

A.cDNA R T 2PCR 产物;

B.第4内含子PCR 产物;

A.R T 2PCR product of cDNA ;

B.PCR product of fourth intron ;图1　猪N PM 1基因cDNA 和第4内含子PCR 产物电

泳(Marker 为100bp 的标准标记)

Fig.1　E lectrophoresis of cDNA and fourth intron PCR

product of porcine N PM 1gene

294个氨基酸。其起始密码子是A T G ,终止密码子

为TAA 。

2.3　序列相似性比较与进化树分析

将测序序列在NCBI 网上进行同源比对,发现所得序列与人、鼠等的N PM 1基因高度同源。将cDNA 序列用DNAstar 软件进行氨基酸预测,并将

该基因预测的编码蛋白与NCBI 蛋白质数据库进行

BL AST 比对,发现其与人N PM 1变异体1(96%)、变异体2(81%)、变异体3(96%)、小鼠(94%)和大鼠(94%)等3种动物具有很高的同源性,表明所得片段确为猪N PM 1基因。将该基因各物种的核苷酸序列进行多序列比对,并作系统发生树分析,发现猪N PM 1基因在分子进化上与人较近源(图2)。2.4　蛋白质保守功能域预测

通过RPS 2blast 程序分析,发现在13～116氨基酸处含有一个典型的Nucleoplasmin 保守结构域(图3)

。

图2　Cluster W 作系统发生树分析

Fig.2　Phylogenetic tree analysis by using Cluster W

method

图3　猪NPM1蛋白结构域

Fig.3　The dom ain of pig NPM1protein

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701・

利用法国农科院提供的猪3啮齿类体细胞杂种板(SC HP)将N PM1基因定位在猪16号染色体q21区段,区域定位的概率为0.8085,错误概率少于0.1%,相关系数达到0.85。辐射杂种板(IM2 p R H)定位结果表明该基因与猪16号染色体上SW977标记紧密连锁,LOD值为9.16。

3　讨　论

N PM1是一个常在肿瘤和干细胞等增殖活跃的细胞中过表达的多功能蛋白。N PM1作为细胞p53的负因子可以防止正常的和恶性的造血细胞在诱导条件下凋亡。N PM1过表达可以抑制诱导性凋亡,N PM1抑制表达会增加DNA损伤诱导凋亡。该基因的C末端是一个与p53互作的结构域,在该结构域发生缺失性突变时,则其编码的蛋白失去抗凋亡作用。许多急性骨髓白血病是同N PM1基因作为核仁定位信号的C末端突变有关[10～12,18]。因此,N PM1基因通过一种与p53相关的机制抵抗凋亡性细胞死亡。研究暗示,N PM1在p53依赖性的凋亡应答起重要作用,并且其在癌症治疗方面具有潜在的效果[19]。B23抗体可以用来鉴定人外周淋巴细胞早期增殖活性[20]。关于N PM1基因的研究近年有不少报道,但主要活跃在该基因与肿瘤发生相关以及其作用机制等领域。

笔者首次在猪中开展N PM1基因的相关研究,在猪胚胎时期的骨骼肌中克隆到该基因长1195bp 包含全部CDS区域的cDNA序列,另外还分离到第4内含子的序列。并通过体细胞和辐射杂种板方法将其定位于猪16号染色体q21区段,与SW977标记紧密连锁。通过cDNA序列开放阅读框预测,猪N PM1基因编码294个氨基酸,与人、鼠的氨基酸高度同源。对氨基酸序列的结构和功能域预测表明,猪N PM1是一种核穿梭蛋白,含有一个Nucleo2 plasmin保守功能域。本研究未克隆到猪N PM1基因的其它变异体,所得序列与人N PM1变异体1一样编码294个氨基酸,同源性达96%,该基因在猪中是否同人一样存在另外的变异体值得进一步研究。关于该基因在不同品种以及不同发育阶段的骨骼肌的表达情况也值得深入研究。该基因在本研究中所得到的初步结果,将为深入开展其功能以及与产肉性状相关研究奠定基础。参考文献:

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保加利亚发生猪瘟

2007年1月17日保加利亚向OIE 通报了古典型猪瘟的情况。疫情始于2007年1月15日,1月17日确诊,病原为猪瘟病毒。此次发生属于临床病例。疫区位于SUM EN 省Smyadovo 地区Smyadovo 村,发病动物为猪,有疑似猪182头,病例6例,死亡4例,销毁178头。诊断方法有临床诊断、实验室检验和尸检。负责诊断的实验室为保加利亚国家古典型猪瘟参考实验室,方法为直接免疫荧光法,结果为阳性。感染来源尚不清楚。保加利亚采取的措施:国内控制移动、筛选、房屋/设施消毒、浸洗和喷雾、隔离检疫、扑杀、控制野生动物及区域化,并且禁止免疫。保加利亚上次发生猪瘟是2006年7月28日。泰国发生高致病性禽流感

2007年1月24日泰国向OIE 通报了高致病性禽流感的情况。此次疫情始于2007年1月19日,1月23日确诊,病原为高致病性禽流感病毒H5N1血清型。属于临床病例。诊断方法有临床诊断、实验室检验和尸检。实验室诊断在家畜开发部所属的东北兽医研究和开发中心(K on Kean )进行,手段为实时R T -PCR 和病毒分离,均为阳性。疫区位于NON G KHA I 省SriChiangMai 地区PanPraow8号村的一个农场。

感染群为产蛋鸡,有1200只18月龄鸡和800只约9月龄的鸡。其中有病例236例,死亡236例,销毁17只。该农场是一个传统的养殖场,缺乏生物安全措施,其周围是野鸟活动频繁的稻田、鱼塘和水库。感染来源正在调查中。泰国采取的措施:国内控制移动、筛选、房屋/设施消毒、浸洗和喷雾、隔离检疫、扑杀及区域化。未对感染鸡进行治疗,并且禁止免疫。泰国上次发生高致病性禽流感是2007年1月9日。捷克发生新城疫

2007年1月30日捷克向OIE 通报了新城疫疫情。此次疫情始于2007年1月15日,1月29日确诊,属于临床病例。诊断方法为临床检验和初步实验室检验。实验室检验由位于布拉格的国家兽医研究所进行,手段是脑内致病指数试验,结果为阳性。病原为禽副黏病毒。疫区位于PARDUBIC KY 省Pardubice 地区的J ezborice 。感染动物是鸽子,共有疑似动物36只,病例3例,死亡1例,销毁35例。感染来源是接触野鸟。捷克采取的措施:国内控制移动、房屋/设施消毒和扑杀。捷克上次发生新城疫是1998年7月。

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