病毒滴定方法

病毒滴定方法

1．样品        

细胞培养中生长的病毒，或保存于储存液中的病毒，都可用于下列程序。

2. 原理        

在进行病毒中和试验之前，所有的病毒必须预先于以定量，以便使中和试验中的病毒与其反应物（如待测病人的血清抗体）相互之间有一个合适的量。病毒滴定是先将病毒作一系列的10倍稀释，再将它们分别加到敏感细胞的培养物上，培养一定时间以后观察病毒生长迹象。滴度的终点是能使50%接种的细胞产生病毒增殖的病毒最高稀释度，称为半数细胞感染量，即TCID50。因此，滴定结果并不是病毒颗粒的准确数量，而是一种稀释度，病毒在这一稀释度时仍然存在并具有感染性。

3. 材料      

3.1        仪器     无菌易盖试管（12 × 75 mm），无菌吸管（1 mL，5 mL），斜架，35°C培养箱，显微镜，振荡器。

3.2        试剂   细菌培养基

4. 方法 

4.1        准备病毒悬液        

如果病毒是从单层细胞培养得到的腺病毒或肠道病毒，可按以下冻融法制备病毒悬液。先将含病毒的细胞管连同其中的培养液一起放入-70°C冷冻。当培养液完全冻结以后，取出置于自来水笼头下以流水融化。重复如此冻融一次。移入离心管，    1500 × g离心10分钟，取上清液滴定病毒。

对于其它病毒（VZV除外），可以用病毒培养的细胞上清液滴定病毒。

4.2        取8支无菌试管，分别标上-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7，-8，这些数字代表稀释度的指数。

4.3          每管中加入0.9 mL细胞培养基

4.4        用100 μL 移液取0.1 mL混匀的病毒悬液（4.1），加入到第1管（-1管）中，盖上盖以后振荡混匀。

4.5        换用一支新的头，从-1管中取0.1 mL移入-2管中，振荡混匀。如此继续稀释至-8管，注意每次移液都必须换用新的头，否则就会将头外面的病毒带入到新的一管，导致过高估计滴度的终点。

4.6          对于一个稀释度，准备2支敏感细胞，作好标记。

4.7        从不同稀释的病毒管中各取0.1 mL接种到相应标记的敏感细胞管中，每个稀释度种2管。每次均换新的头。

将细胞管送入培养箱，培养7天（有些生长慢的病毒需要更长时间）。其间经常观察

病毒生长迹象。

  以每个稀释度的两管中至少有一管出现细胞病变的最高稀释度为滴定的终点。滴

定终点意味着含有一个TCID50的稀释度。在病毒鉴定过程中，一般使用含有100个TCID50或1000个TCID50的稀释度。计算100 TCID50时，在TCID50的指数上加上2；计算1000 TCID50 时，在1 TCID50指数上加上3。例如，假如一个病毒悬液的滴定终点是10-6稀释度，即0.1 mL的10-6稀释的病毒悬液中含有1 TCID50，那么其100个TCID50的计算是:

6.0（1个TCID50的指数）+2（100的指数）=-4.0（待稀释的指数）

就是说，10-4稀释的病毒悬液中，其0.1 mL含有100个TCID50。