生物工程综合实验

土壤微生物蛋白酶的筛选与提取总结报告

摘要：土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，我们可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。本实验采用平板分离法从土壤混杂的微生物群体中筛选出产蛋白酶的菌种。大体初筛、复筛、测试发酵条件、小型发酵罐发酵，最终对发酵液进行蛋白酶提取。经过初筛和复筛，从土壤中得到一个碱性蛋白酶高产菌株，作为目的菌株，其酶活为 1.608U/ml，并用于发酵产生蛋白酶。在微生物发酵过程中，培养基、温度、PH等多种因子对发酵有较大的影响，并且还会产生交互作用，需要通过试验了解这多个因子的联合效应。用正交法，利用正交表来安排与分析多因素试验，通过不同的水平组合培养菌种，最终找出最优组合，按比例放大用于发酵罐发酵。发酵完成后，取发酵液，可直接用盐析离心的方法得到蛋白酶。

关键词：分离纯化 菌种筛选 正交法  培养发酵 盐析 冷冻离心

1.产蛋白酶菌种的初筛

1.1实验材料

样品：土壤样品

培养基：酪素培养基（配方 ：葡萄糖0.5g NaCl 5g  K2HPO4 0.5g  KH2PO4 0.5g

酪素10g 蒸馏水1000ml 琼脂20g pH 7.5）

试剂：1mol/L HCl  1mol/L NaOH  2.5%三氯乙酸

仪器用具：高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，天平，无菌玻璃涂棒，量筒，移液管，三角瓶，试管，玻璃棒，培养皿，玻璃珠

1.2实验方法

1.2.1培养基制备

通过称量，溶解，调节pH等步骤，配制酪素培养基，并配制90 ml无菌水（内装几颗玻璃珠）1瓶，4.5 ml无菌水若干支，0.1MPa灭菌30min后备用；另包扎好培养皿，移液管，玻璃涂棒，头等，灭菌，烘干备用

1.2.2倒平板

将灭过菌的酪素培养基加热融化待冷至55-60℃，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约 20ml，冷却凝固待用

1.2.3制备土壤稀释液

称取土样10g，放入盛90 ml无菌水并带玻璃珠的三角瓶中，振摇约20 min，使土样与水充分混合，将细胞分散，即为 10-1的土壤稀释液

取4.5 ml无菌水4支，用记号笔编上10-2，10-3 ，10-4，10-5。用无菌移液管从中吸取0.5ml10-1的土壤悬液加入盛有4.5 ml无菌水的试管中，充分混匀配成10-2稀释度的土壤溶液，然后依次吸取0.5 ml加入别的试管中分别配成10-3，10-4，10-5不同稀释度的土壤溶液

1.2.4涂布

将上述平板分别用记号笔写上10-3 ，10-4，10-5，每个稀释度标三个平板，然后用无菌移液管分别由10-3，10-4，10-5的土壤稀释液中各吸取100ul对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温下静止5-10min，使菌液吸附进培养基

1.2.5培养

将涂布好的平板倒置在恒温培养箱中28℃培养2-3天。培养后在平板上滴加2.5%三氯乙酸溶液，以刚铺满平板为度。菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌产生蛋白酶。若杂菌干扰不严重，可适当延长平板的培养时间，以便挑取生长速度较慢的菌株

1.3实验结果

10-3	10-4	10-5
25个微黄菌落周围有透明圈，涂板不均匀导致有几个菌落长一块。	16个微黄菌落，周围也带透明圈，透明圈都较大并不是明亮。	5个大小不一明显带透明圈的菌落

这次实验在我们配制酵素培养基时颜色就比较深，与其他组均有明显区别，有可能是我们组的PH调高了一点，使得酵素充分溶解，通过这不同稀释度的培养基也能看到长有透明切明亮透明圈的菌落。

1.4思考题

1.4.1除涂布法外，你还知道那些分离方法？比较各种分离方法的优缺点？

答：应该还有平板画线法；稀释倒平板法和搁斜面法。 

稀释混合平板法：  优点：可以计数，吸收量为1ml，较方便。 优点：不能观察菌落特征。 一般用于菌落总数的计数。 

平板划线法：  优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。 缺点：不能计数 一般用于从菌种的分纯。 

涂布法使用较多，但有时不均匀，稀释倒平板法操作相对麻烦，不适合好氧和对热敏感的细菌培养 ，应用范围：涂布法适用于好氧菌，稀释倒平板法适用于厌氧，兼性厌氧。

1.4.2菌株的选育为什么要分初筛与复筛？

分布进行可以减少实验量，同时能够更好更高效的对目的菌株进行分离。

1.4.3  查找资料，根据所在地的特殊生态环境（如盐湖，温泉，酸性土壤等），设计一个筛选方案来筛选这些生境中的特有微生物。

答：从盐湖筛选嗜盐菌

从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。

（1）培养嗜盐菌的菌样应从盐湖采集。

（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对嗜盐菌微生物的富集培养应选择特定的酪素培养基，并在充分含盐条件下培养。

（3）接种前要对培养基进行高压蒸汽灭菌处理。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在灭菌条件下进行。

（4）按不同稀释度涂板。接着对培养基进行平板划线。

（5）将涂布好的平板倒置在恒温培养箱中28℃培养2天。若长出菌落则是嗜盐菌菌落。

2.产蛋白酶菌种的复筛

2.1实验材料

从1中初筛得到的两个菌株

2.2实验方法

2.2.1菌液准备

配制葡萄糖蛋白胨水培养基400mL分装于4个250mL三角瓶，0.1Ma灭菌20分钟。将2个菌株用接种环接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，每个菌株接种2瓶

2.2.2菌种保存

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基30mL，分装于4支试管，盖上试管帽，灭菌，作4支斜面。用接种环接种2个菌株，每个菌株2支斜面保存

2.2.3培养

菌液放于37℃、摇床（140转/分）培养18—20h，斜面菌种放于37℃恒温培养箱培养

2.2.4菌体密度测定

菌液培养18—20h后，用无菌移液头取1mL 菌液于无菌试管中，用无菌水稀释2-3倍，在600nm下测定吸光度

2.2.5菌液酶活测定

菌液培养18—20h后，用无菌移液头取6ml 菌液于10 ml离心管中，严格配平，4℃、6000转/分离心10分钟，取上清液测定菌株胞外蛋白酶活性

2.2.5.1样品管处理：

吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置于试管中，在40℃水浴中预热5分钟后加入同样条件下预热好的菌液上清液1 mL，立即计时。反应10分钟后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3 mL，室温下放置15分钟后，4℃、6000转/分离心10分钟

2.2.5.2对照管处理：

同时另作一对照管，即取酶液（即菌液上清液）1 mL，先加入3 mL10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%的酪蛋白溶液2 mL，40℃水浴中保温10分钟，室温放置15分钟，4℃、6000转/分离心10分钟

2.2.5.3显色

取3支试管，编号。分别加入样品处理及对照处理上清液和水各1 mL，然后各加入0.55mol/L的碳酸钠溶液5 mL，混匀，立即加入Folin试剂1 mL，立即混匀，40℃水浴中显色15分钟

2.2.5.4吸光度测定

以加水的一管作为空白，测定样品及对照在680nm下的吸光度A680

2.2.5.5菌株酶活比较

（A样—A对）/A菌密度

2.3实验结果

4瓶培养基，在680nm下测得吸光度，计算酶活
T	Tc	S	Sc
1.285	1.279	1.295	1.275

T：教师；Tc：教师对照；S：样品；Sc：样品对照

从数据得出，学生组菌落产生蛋白酶的酶活要比老师组菌落产生的酶活要强的太多，土样稀释涂布后，菌落生长缓慢，有可能是在涂布出现误差，同时在使用紫外分光光度计时，有可能是比色皿没清洗干净。最后一点，有可能学生组的菌株确实要比老师组的长得好。

3.正交法发酵培养条件优化

3.1实验材料

3.1.1试剂

1.1和2.1中相关试剂

3.1.2器材

恒温水浴锅、分析天平、0.1-5 ml吸管、722型分光光度计、试管及试管架、秒表、离心机、恒温摇床

3.2实验方法

3.2.1培养基的配置（见表1）

结合正交设计方案表1、表2中所给出的培养基组分和浓度以外，按照如下组成及要求制备培养基：葡萄糖  10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾5g/L，pH 7.2。根据发酵瓶大小配置的量。将上述培养基配制好以后，每250 mL/500mL三角瓶装入培养基50/100 mL，于121℃下灭菌30 min，冷却

表1  正交表实验方案

编号	葡萄糖 (A)	酵母膏 (B)	吐温-80 (C)	酶活(OD）
1	(1)	(1)	(1)	6.6732
2	(1)	(2)	(2)	-1.3668（舍弃）
3	(1)	(3)	(3)	5.1456
4	(2)	(1)	(2)	2.1708
5	(2)	(2)	(3)	4.5828
6	(2)	(3)	(1)	4.9044
7	(3)	(1)	(3)	1.5276
8	(3)	(2)	(1)	5.4672
9	(3)	(3)	(2)	3.6180
k1	5.9094	3.4572	5.6816
k2	3.8860	5.0250	2.44
k3	3.5376	4.5560	3.7520
极差	2.3718	1.5678	2.7872

3.2.2冷却后接种（接种量为10％），置于37℃培养箱进行培养

3.2.3测定酶活

按照蛋白酶活力测定方法进行。姜末或数据填写如表2中，对数据进行分析，确定最佳发酵条件

3.3实验结果及分析

3.3.1标准曲线

葡萄糖含量 (mg/mL)	吸光度 A483
0.00	0.000
0.25	0.069
0.50	0.123
0.75	0.232
1.00	0.332
1.25	0.434
1.50	0.543
1.75	0.603
2.00	0.693
2.50	0.766
回归方程：      y=0.33485x-0.0056
相关系数：      r=0.99234正相关强
相关指数：      R=0.98473回归效果较好
残差平方和：   0.010041

回归方程：  y=0.33485x-0.0056

3.3.2正交结果

9个摇瓶
在483nm， 以DNS调零测葡萄糖/Abs		酶活（48h，左样品，右对照）/Abs
1	0.106	1	0.791	0.708
2	0.100	2	1.325	1.342
3	0.063	3	1.582	1.518
4	0.370	4	0.878	0.851
5	0.221	5	1.454	1.397
6	0.142	6	1.794	1.733
7	0.876	7	0.925	0.906
8	0.292	8	1.603	1.535
9	0.682	9	1.878	1.833

由上表，将结果带入葡萄糖标准曲线，及计算酶相对吸光度的酶活得到如下结果：

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
糖含量/mg/ml	0.333	0.315	0.205	1.122	0.677	0.441	2.633	0.8	2.053
酶活	0.083	-0.017	0.0	0.027	0.057	0.061	0.019	0.068	0.045

3.4思考题

3.4.1为什么培养基和培养条件涉及的多个参数会有交互作用？

因为微生物在细胞中的代谢设计各种条件，交叉之后的因素组合形成形成新的条件，不同的条件之间会共同作用于细胞，影响其代谢，所以在设计时不同条件相互组合会有不同的结果，从而产生对细胞代谢最有利的配方。

3.4.2除了正交试验设计以外，还有那些实验设计方法可用于发酵过程的初步优化？

①单因素法：保持培养基中其他所有组分的浓度不变，每次只研究一个组分的不同水平对发酵性能的影响。这种策略的优点是简单、容易，结果很明了，培养基组分的个体效应从图表上很明显地看出来，而不需要统计分析。但是容易忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；

②均匀设计：是将数论与多元统计相结合而建立起来的一种试验方法，均匀设计最适合于多因素多水平试验，可使试验处理数目减小到最小程度，仅等于因素水平个数。

③全因子实验设计：各因素的不同水平间的各种组合都将被实验。全因子的全面性导致需要大量的试验次数。一般利用全因子设计对培养基进行优化实验都为两水平，是能反映因素间交互作用（排斥或协同效应）的最小设计。

④部分因子设计：全因子设计所需试验次数实际不可行时部分重复因子设计是一个很好的选择。在培养基优化中经常利用二水平部分因子设计

出以上设计方法外，还有对培养基优化实验进行数学统计的方法，如响应曲面分析法、改进单纯形优化法、遗传算法等。

⑤Plackett-Burman设计：由Plackett和Burman提出，这类设计是两水平部分因子试验，适用于从众多的考察因素中快速、有效的筛选出最为重要的几个因素，供进一步详细研究用。理论上讲PB试验应该应用在因子存在累加效应，没有交互作用—因子的效应可以被其他因子所提高或削弱的试验上。

3.4.3  本实验中除了测定蛋白酶活力以外还可以选择那些参数作为优化指标？

葡萄糖的消耗量，菌体浓度等。

4.发酵罐发酵

按比例将实验3中得到的最优配方培养基放大至3L，发酵48小时，每6小时取样测一次发酵液中的菌体密度和酶活。

4.1实验结果及分析

发酵罐
时间	菌浓	葡萄糖浓度 稀释10倍后测得	酶活 （按Folin法，其中对照组为1.1）
0h	0.267	0.540	1.169
6h	0.554	0.554	1.168
12h	0.620	0.550	1.177
18h	0.622	0.507	1.141
24h	0.510	0.610	1.194
30h	0.391	0.495	1.112
36h	0.396	0.652	1.137
42h	0.516	0.829	1.215
48h	0.694	0.872	1.237

补料速度和比生长速度直接影响乙酸的生产，而乙酸会抑制大肠杆菌的生长，当乙酸浓度大于10g/L时，菌类将停止生长，所以要严格控制好补料速度和量。还有就是PH的控制，经过查资料知道，PH过高会不利于代谢产物的积累；PH的过低会抑制菌体生长，亦可能引起菌体的衰老和自溶。

5.蛋白酶的分离提取

5.1实验材料

试剂：蛋白酶发酵液， PBS（0.1moL/L，pH7.84），研细干燥的硫酸铵固体粉末，测酶活试剂（共7组，共需酪蛋白100 ml, 三氯乙酸150ml, 碳酸钠70 ml和Folin试剂60-70ml）

仪器：有离心机 4000~10000rpm （冷冻式），紫外分光光度计；水浴箱；电子天平；台式天平（离心平衡用）、试管（14支），烧杯（3个100ml），吸管(3个)，玻棒(3根)，移液管(5ml, 3ml, 2ml)，量筒(50ml),离心管(50ml,10ml)

5.2实验方法

5.2.1酶的粗提取

5.2.1.1将摇瓶发酵液分装于2支离心管中（50ml ），平衡质量， 在4°C条件下8000rpm 离心15min

5.2.1.2弃沉淀,取上清液,使用量筒测量上清液体积,计算硫酸铵饱和浓度从0%-40%, 40-70%,70%-90%所需投入硫酸铵的质量(在附录中查出相应的硫酸铵饱和度)。 在小烧杯中，将硫酸铵缓慢加入到发酵液的上清液中,边加边搅拌至完全溶解。放置半个小时后,离心移入50ml离心管2支中, 平衡重量后, 在4°C 条件下9000 rpm离心15min，保留离心得到的沉淀，做好标记。将上清液移入到一个小烧杯中，加入硫酸铵使得饱和度从40%提高到70%，如此共分3次分别加入不同量的硫酸铵，按照不同的硫酸铵饱和度范围连续得到3个级分蛋白沉淀。

5.2.1.3每份沉淀加7ml PBS 0.1M pH7.8 溶解（使用不同的玻璃棒搅拌溶解），进行酶活测定

5.2.2酶活测定方法

5.2.2.1样品管处理

吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置于试管中，在40℃水浴中预热5分钟后加入同样条件下预热好的酶液1 mL，立即计时。反应10分钟后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3 mL，室温下放置15分钟后，4℃、6000转/分离心10分钟

5.2.2.2对照管处理

同时另作一对照管，即取酶液1 mL，先加入3 mL10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%的酪蛋白溶液2 mL，40℃水浴中保温10分钟，室温放置15分钟，4℃、6000转/分离心10分钟

5.2.2.3吸光度测定

以加水的那一管作为空白，测定样品及对照在680nm下的吸光度A680

5.3实验结果及分析

未能测到酶活。由于之前发酵罐接种出现了；也有可能是蛋白酶受到破坏。冷藏，并加入稳定剂。这些稳定剂一般都能充分保持蛋白酶的生物活性。

实验心得总结：

蛋白酶是土壤有机氮水解为氨基酸过程中重要的酶。蛋白酶能够分解蛋白质、肽类为氨基酸，参与调节生物的氮素代谢，是促进土壤氮循环的重要组分。在实验中还有很多需要注意的细节，由于是微生物实验，就要尤其小心其他杂菌的混入影响实验结果。这次培养皿中的微生物有的长成一片，主要是涂布还是没很好把菌液涂均匀。还有这次的蛋白酶提取也是失败的，在发酵液里并没有测得酶活。其中原因通过菌浓看出菌类并没有被杀死，所以蛋白酶很有可能是被破坏掉了。

这次综合实验是个循序渐进的过程，让人学到了很多与微生物实验相关的技巧，深化了对微生物本身更实质上的了解，毕竟之前容易对微生物比较系统的问题很混淆，经过实验概念问题是不可能再犯的了，也算是对以前做过的微生物实验的总结。最主要的是，锻炼了我们自主实验、团队合作和分工、探讨和分析问题、寻求最佳方案和代替解决方案的能力。同时我们也要积极思考，提前安排好试验计划，每个团队的成员分工合作，提高实验效率。