SDS-PAGE实验步骤

1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）  　　50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，

   0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。   H

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，

   4℃保存，一般可放置1个月。

33. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。5 v) L: Q, N7 y

5.   TEMED（四乙基乙二胺）原液。; _' Z0 Z1 g   V( M# p* t/ O

6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。+ q! c* B0 a+ p1 j+ k, I6 G   h1 d

7.   pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

   置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到

250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。: s! o# E' e% W. h

SDS-PAGE凝胶的有效分离范围 

　　电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。; c$ }7 M$ U* s4 e   a

样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。* t( A) i; a" ^( g

电泳8 l# j" s) S! j. b

1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；4 ^* P# j2 G: h: G% M' }2 ^6 u

2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；

3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；1 `; _5 w2 n: F   C# c" }/ ?

　　ddH2O                               3.0 ml

    1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8           2.1 ml; K7 Q1 n4 |7 @6 R+ ~

   30% Acr-Bis                          2.8 ml

    10% SDS                             80 ul

    10%AP                               56 ul4 q- ]. o9 s" p5 A" A: k4 N1 V" F

　　TEMED                            6 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* }* A: ^$ ?   y

4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；) H1 U% |/ ~1 G; d

5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀； 

ddH2O                               2.0 ml

    1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8           400 ul Q1 n4 |7 @6 R+ ~

   30% Acr-Bis                          600 ul

    10% SDS                             36 ul

    10%AP                               24 ul4 q- ]. o9 s" p5 A" A: k4 N1 V" F

　　TEMED                               4 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* }* A: ^$ ?   y

6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；

7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;- Q4 Y3 p5 e6 O3 Y0 {

8. 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr；& A8 T7 s/ C2 |, y; P7 E9 t& S

9. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。$ R" r! L7 F* L   h

SDS-PAGE胶的干燥

凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形，但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量，因此，应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态，使其真空压力波动极少。& A- E& i1 }1 |9 y% H5 O8 X; C

试剂配制步骤0 T2 o- m! n* Y3 C

1. 固定液：冰醋酸:甲醇:水（10:20:70）

2. 电泳后的凝胶用5～10倍体积固定液在室温下固定，酸性固定液扩散后可使凝胶中的溴酚蓝变黄。蓝色全部消失后，继续固定5min。为防止凝胶破裂，在进行此步骤之前可将凝胶浸泡于含20%甲醇、30%甘油的溶液中过夜。& A4 Q: Y# [- E9 V- Z

3. 将凝胶标记好方向后放在保鲜膜或玻璃纸上面，上面放一张比凝胶四周长出1～2cm的Whatman 3MM滤纸。

4. 另将一张滤纸放在凝胶干燥器上。将Whatman 3MM滤纸/凝胶/保鲜膜或玻璃纸，放在凝胶干燥器上的滤纸上面，保鲜膜或玻璃纸在最上面。6 j1 ~" _   e1 ^( y$ J0 l

5. 放下凝胶干燥器的盖子，抽真空使凝胶四周封闭以干燥凝胶，干燥时间常由厂家提供，一般0.75mm厚凝胶干燥2h，如50～65℃可加快干燥进程。/ Y7 n0 L% B6 U

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

操作步骤

1、凝胶制备：

用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。

2、上样：

分别取样品若干ml于离心管中，按1/1～1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3～5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30μl不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2～3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2cm时，即可停止电泳。

3、染色：

电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。