1. 确认目的 2
2. 参考文件 2
3. 试验器材 2
4. 菌液制备与检验 2
5. 需养菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 3
6. 控制菌检查方法的验证 4
7. 试验结果 5
8.验证结论 9
1.目的
确认对供试品进行微物限度检查时，所采用的需养菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法是否适合于该药品的微生限度检查。
2.参考文件
《中国药典》2015版四部
3.试验器材及样品
3.1培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、
麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、十六烷基三甲铵琼脂培养基。
以上培养基均由北京三药科技开发公司生产
3.2菌种
大肠埃希菌（scherichia coli) [CMCC(B) 44102]
枯草芽孢杆菌（Bcillus scbtilis ) [CMCC(B) 63501]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus ） [CMCC(B) 26003]
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ) [CMCC(B) 10104]
白色念珠菌（Candida albicans) [CMCC(F) 98001]
黑曲霉 （Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003]
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉均由中国医学菌种保藏中心提供
3.3环吡酮胺乳膏 批号151201、151202、151203
4.菌液制备与检验
4.1取经30-35℃培养18-24h的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释，金黄色葡萄球菌稀释至10-7、枯草芽孢杆菌稀释至10-5、大肠埃希菌稀释至10-7，约为50～100cfu/ml，备用。
4.2取经20-25℃培养2-3天白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基的培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
4.3取经20-25℃培养5-7天黑曲霉的沙氏葡萄糖液体培养基的培养物，加5ml含0.05%（ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。吸取出孢子悬液，用0.05%（ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，约为50～100cfu/ml，备用。
上述各株菌的培养物均为第三代的培养物。
4.4菌液的检验
4.4.1取上述金黄色葡萄球菌107、枯草芽孢杆菌105、铜绿假单胞菌107的稀释液各1ml，分别用45℃胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两个平皿，30-35℃培养逐日观察计数，应约为50～100cfu/ml。结果见 表1
4.4.2取上述白色念珠菌105稀释液及上述黑曲霉104孢子悬液各1ml,分别用45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注入平皿，各副行测定两个平皿，30-35℃培养逐日观察计数，应约为50～100cfu/ml。结果见表1
5.需养菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 结果见 表2-7
照中国药典2015版微生限度检查法（中国药典2015年版四部1105、1106）中微生物计数方法和控制菌检查法进行试验。
供试液的制备：取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，制成匀浆液，作为1：10的供试液。
5.1考虑到环吡酮胺对真菌具有较强的抑制作用,对球菌、杆菌亦有抑制作用,故采用培养基稀释法进行试验。结果见表2-7
5.1.1试验组：取供试液分别按0.5ml/皿、0.2ml/皿加入平皿后，加入上述不大于100cfu的试验菌，立即倾注2015版四部药典规定的培养基，置规定的温度培养5-7天，逐日观察结果。
5.1.2菌液组：除不加供试液外，其他同试验组测定法。
5.1.3供试品对照组：除不加菌液外，其他同试验组测定法。
5.1.4回收率的计算：按如下公式计算试验组加菌回收率。
试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数
试验组的加菌回收率=---------------------------------------------
菌液组的平均菌落数
5.2薄膜过滤法：结果见表2-7.
5.2.1试验组：取1：10供试液1ml加至500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，全部通过开放式滤器后（滤膜先用冲洗液润湿），用500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入上述不大于100cfu的试验菌，冲洗完成毕后，滤干，取出滤膜贴于规定的培养基平板上，置规定的温度培养5-7天，逐日观察结果。
5.2.2菌液组：以500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，其他同试验组测定法。
5.2.3供试品对照组：除不加菌液外，其他同试验组测定法。
5.2.4回收率的计算：按如下公式计算试验组加菌回收率。
试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数
试验组的加菌回收率=---------------------------------------------
菌液组的平均菌落数
6.控制菌检查方法的验证
本品为皮肤给药制剂,根据《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法项下规定,皮肤给药制剂均需做金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查方法的验证：结果见表8.
6.1按常规法：
6.1.1试验组：取1：10的供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入上述不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，混匀，30-35℃培养18-24小时。
6.1.2阴性对照组：以10ml的 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30-35℃培养18-24小时。
6.1.3 阳性对照组：以10ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入上述不大于100cfu的大肠埃希菌，混匀，30-35℃培养18-24小时。
6.1.4供试品组：供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30-35℃培养18-24小时。
6.2按薄膜过滤法
6.2.1试验组：取1：10的供试液10ml至500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，全部通过开放式滤器后（滤膜先用冲洗液润湿），用500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，100ml/次，冲洗完成毕后，滤干，取出滤膜加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入上述
不大于100cfu的大肠埃希菌，30-35℃培养18-24小时。
6.2.2阴性对照组：以10ml氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液加至500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，全部通过开放式滤器后（滤膜先用冲洗液润湿），用500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，100ml/次，冲洗完成毕后，滤干，取出滤膜加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30-35℃培养18-24小时。
6.2.3阳性对照组：以10ml氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液至500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，全部通过开放式滤器后（滤膜先用冲洗液润湿），用500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，100ml/次，冲洗完成毕后，滤干，取出滤膜加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入上述不大于100cfu的大肠埃希菌，30-35℃培养18-24小时。
6.2.4供试品组：取1：10的供试液10ml至500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，全部通过开放式滤器后（滤膜先用冲洗液润湿），用500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，100ml/次，冲洗完成毕后，滤干，取出滤膜加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30-35℃培养18-24小时。
7.试验结果
表1、试验用菌液检查 （菌落计数单位：cfu )
| 试验次数 | 计数方法 | 铜绿假单胞菌10-7 | 金黄色葡萄球菌10-7 | 枯草芽孢杆菌10-5 | 白色念珠菌10-5 | 黑曲霉 10-4 | ||||||||||||
| 1 | 平皿法 | |||||||||||||||||
| 平均 | ||||||||||||||||||
| 薄膜过滤法 | ||||||||||||||||||
| 2 | 平皿法 | |||||||||||||||||
| 平均 | ||||||||||||||||||
| 薄膜过滤法 | ||||||||||||||||||
| 3 | 平皿法 | |||||||||||||||||
| 平均 | ||||||||||||||||||
| 薄膜过滤法 | ||||||||||||||||||
| 方法 | 实验 次数 | 菌液组 | 试验组 | 供试品对照组 | 回收率应(0.5-2) | ||||
| 菌落数平均 值 | 菌落数 | 平均值 | 菌落数平均值 | 平均值 | |||||
| 1 | 2 | ||||||||
| 培养基稀 释法 （0.5ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 培养基稀 释法 （0.2ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 薄膜过滤法 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 方法 | 实验 次数 | 菌液组 | 试验组 | 供试品对照组 | 回收率应(0.5-2) | ||||
| 菌落数平均 值 | 菌落数 | 平均值 | 菌落数平均值 | 平均值 | |||||
| 1 | 2 | ||||||||
| 培养基稀 释法 （0.5ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 培养基稀 释法 （0.2ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 薄膜过滤法 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 方法 | 实验 次数 | 菌液组 | 试验组 | 供试品对照组 | 回收率应(0.5-2) | ||||
| 菌落数平均 值 | 菌落数 | 平均值 | 菌落数平均值 | 平均值 | |||||
| 1 | 2 | ||||||||
| 培养基稀 释法 （0.5ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 培养基稀 释法 （0.2ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 薄膜过滤法 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 方法 | 实验 次数 | 菌液组 | 试验组 | 供试品对照组 | 回收率应(0.5-2) | ||||
| 菌落数平均 值 | 菌落数 | 平均值 | 菌落数平均值 | 平均值 | |||||
| 1 | 2 | ||||||||
| 培养基稀 释法 （0.5ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 培养基稀 释法 （0.2ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 薄膜过滤法 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
表6、枯草芽孢杆菌计数方法的验证 （菌落计数单位：cfu )
| 方法 | 实验 次数 | 菌液组 | 试验组 | 供试品对照组 | 回收率应(0.5-2) | ||||
| 菌落数平均 值 | 菌落数 | 平均值 | 菌落数平均值 | 平均值 | |||||
| 1 | 2 | ||||||||
| 培养基稀 释法 （0.5ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 培养基稀 释法 （0.2ml/皿） | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 薄膜过滤法 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 方法 | 实验 次数 | 菌液组 | 试验组 | 供试品对照组 | 回收率应(0.5-2) | |||||
| 菌落数平均 值 | 菌落数 | 平均值 | 菌落数平均值 | 平均值 | ||||||
| 1 | 2 | |||||||||
| 平皿法 | 1 | |||||||||
| 2 | ||||||||||
| 3 | ||||||||||
| 培养基稀 释法 （0.5ml/皿） | 1 | |||||||||
| 2 | ||||||||||
| 3 | ||||||||||
| 培养基稀 释法 （0.2ml/皿） | 1 | |||||||||
| 2 | ||||||||||
| 3 | ||||||||||
| 薄膜过滤法 | 1 | |||||||||
| 2 | ||||||||||
| 3 | ||||||||||
表8、控制菌检查方法的验证结果
| 控制菌 | 试验次数 | 方法 | 试验组 | 阴性对照组 | 阳性对照组 | 供试品组 |
金黄色 葡萄球 | 1 | 平皿法 | ||||
| 薄膜过滤法 | ||||||
| 2 | 平皿法 | |||||
| 薄膜过滤法 | ||||||
| 3 | 平皿法 | |||||
| 薄膜过滤法 | ||||||
铜绿假 单胞菌 | 1 | 平皿法 | ||||
| 薄膜过滤法 | ||||||
| 2 | 平皿法 | |||||
| 薄膜过滤法 | ||||||
| 3 | 平皿法 | |||||
| 薄膜过滤法 |
检查人： 日期： 复核人： 日期：
8.验证结论
| 验证项目名称 | 乳膏剂微生物限度检查验证方案 |
| 验证起讫日 | 年 月 日—— 年 月 日 |
验证结论：从3次的平行试验结果可知,本品具有较强的抑菌作用,采用培养基稀释法难以消除其抑菌活性,但改用薄膜过滤法(冲洗量每膜500mL),经菌落计数法验证,试验组与稀释剂对照组的5种试验菌株回收率均在0.5-2内;并且控制菌检查验证结果也符合药典规定。故本品采用薄膜过滤法可消除环吡酮胺乳膏的抑菌作用,适用于该制剂的微生物限度检查。
签名： 日期： | |
| 再验证周期：检验方法发生改变时再作验证。 | |
| 验证委员会成员会签: | |
| 验证小组成员会签: | |
| 验证委员会副主任意见: 签 名： 年 月 日 | |
| 验证委员会主任批准意见:
签 名 ： 年 月 日 | |
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