考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量定_修改后_

一、目的：学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。

二、原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

二、材料、主要仪器和试剂

1．实验材料：牛血清

2．主要仪器：试管、微量取样器、分光光度计等。

3．试剂

（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。

（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

（3）乙醇

（4）磷酸（85％）

四、操作步骤

1．标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

表1 低浓度标准曲线制作

 2．待测样品中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：取一定牛血清，用蒸馏水稀释后备用。

（2）测定：另取2 支10mL 试管，按下表取样。吸取测定液0.1mL（做一重复），蒸馏水0.9 mL放入试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1 号试管做空白。

五、结果计算

计算每毫升测定液中蛋白质的含量？

六、附 注

1．Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。

3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其

结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。

七、思考题

制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管混匀？