传代细胞制备流感病毒疫苗工艺研究进展

吕宏亮1,付秀花1,郑明2

(1.乾元浩生物股份有限公司,北京100081;2.中国兽医药品监察所,北京100081)

[收稿日期]2009-05-05[文献标识码]A[文章编号]1002-1280(2009)06-0043-06[中图分类号]S859.797

[摘要]目前人及动物用流行性感冒病毒疫苗(流感疫苗)的生产大多采用鸡胚。这种传统的方法劳动强度大,鸡胚用量大,需要繁琐的纯化工艺去除鸡胚蛋白减少过敏反应,流感的大流行性以及新发流感的流行迫切需要一种新的疫苗生产方法:用哺乳动物细胞生产疫苗。细胞生产流感疫苗经过研究和发展,从可用于生产的Vero、MDCK、PER-C6细胞的生物学鉴定、分析到流感病毒的重配、适用、培养以及下游工艺的悬浮培养、浓缩、纯化、安全以及效果观察都取得长足进展。本文从细胞流感疫苗的细胞基质、病毒适用、重配、培养、浓缩、纯化及其疫苗的安全、效果观察方面综述了细胞流感疫苗的研发重点。

[关键词]传代细胞;流感疫苗;研究进展

Advance i n C ell Derived Infl uenza V i rus V acci ne Process Develop m ent

LU H ong-liang1,FU X iu-hua1,Z HENG M i n g2

(1.Qianyuanhao B iol og ic a l Co.,L t d,B eiji ng100081;2.Ch ina Instit u te o f Ve t eri na ry Drug Con trol,Be i jing100081;Ch i na)

Abst ract:Th is article discussed the m a mm a li a n ce ll line used to gro w influenza virus adapted cu lti v ation,as w ell as do w nstrea m process developm en,t suspension cultivati o n,concen trati o n,purifi c ation for infl u enza vaccines.

I nfluenza v ir uses for production w ere presen tl y pr oduced i n e mbryonated hen.s eggs.This conventional standar d m ethodo logy w as ex tre m e l y cum berso m e;it required m illions of eggs and an ex tensi v e purification to reduce the a m ount o f conta m i n ati n g egg pro teins and to m i n i m ise the r i s k o f a ll e rg ies against egg a l b um in.The sho rtage o f eggs in a pande m ic sit u ation,the se lection of egg-adapted vari a nts and the presence of adventiti o us v ir uses has e m phasised the necessity for production of influenza vaccines on a w ell characterised stable m a mm a li a n ce ll li n e. M a mm a li a n cell-der i v ed vacc i n es,produced i n nontu m or i g en ic cell li n es,have been deve l o ped and sho wn to be effective producti o n syste m s as alter natives to eggs.E stab lished V er o,MDCK,PER-C6techno logy has been successfully adapted to isolati o n,reassortant v irusw ith reverse genetics to generate h i g h gro w th v irus strain as w ell as to lar ge scale pr oducti o n o f a huge variety of i n fluenza v ir us stra i n s.The producti o n i n1~1200liter fer m en ter cu ltures under serum free conditi o ns gave antigen yie l d s co m parable to the conventi o na l e mbryonated egg tec hno l o-gy.The deve lopm ent of a rap i d and effic ient purificati o n sche m e resulted in a safe h i g h purity vaccine wh ich w as at least as i m munogen ic as conventi o na l egg-derived vacc i n es in am ouse m ode.l C li n ica l trials in d ifferent reg ion de m onstrated that the cell-derived infl u enza vacc i n e w as w ell tolerated,safe and h i g hly i m m unogen ic in hum ans. K ey w ords:cell line;influenza v ir us vacc i n e;research progress

作者简介:吕宏亮(1966年-),博士,主要从事病毒性疫苗研究和生产。E-m a i:l hong liangnvs@i ho t m a i.l com人和动物的流感总是不断地危及人和动物的健康以致生命安全,造成严重的社会影响和经济损失。近年来禽流感不仅在一些国家和地区流行,给养禽业带来重大的损失,而且禽流感病毒感染人并致人发病和死亡。特别是最近源自墨西哥的新流感毒株引起的人甲型H1N1流感在不长的时间里已波及世界达74个国家和地区,发病人数超过二万人,其中死亡一百多人;在加拿大还出现该新流感毒株由人传至猪群并致其发病的病例。一些流感病毒打破了感染宿主的种属界限,应引起我们高度的警惕,并做出相应的对策。

接种人和动物流行性感冒病毒疫苗(流感疫苗)是预防流感、控制人和动物流感大流行、预防动物流感感染人或人流感感染动物的最经济且行之有效的方法。传统的制备流感疫苗的方法需采用鸡胚,培养周期过长,不得不对数百万个鸡胚逐一进行接种和收获,生产过程很难实现全程自动化,劳动强度大,时间消耗多,不易于质量控制和保证,有时病毒不能在鸡胚上复制,产量低。如果要保证鸡胚的供应,疫苗生产前6个月就要做好详细的安排[1]。鸡胚存在潜在污染的可能,且鸡胚培养的流感病毒经过连续传代后常常引起变异,使所制备的流感疫苗抗原性与人群(或畜禽群)中的流感毒株不能完全匹配。鸡胚尿囊液中杂质比较多,使疫苗生产后期的浓缩难度(容易堵塞)增加,鸡胚还可能因存在潜在病毒的污染而降低敏感性。只有那些经过认证的养鸡场才可以提供无抗体、无潜在致病因子污染的SPF鸡胚。另外,在禽流感高发期,可能会因为鸡的大量感染死亡而缺乏制备疫苗的原料,且此时如果仍使用鸡胚生产流感疫苗,则存在着极大的安全隐患。因此,WHO建议使用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗,使其抗原性更接近自然流行株,还可减少宿主蛋白成分,降低接种对象的变态反应[2],如牛肾传代细胞(M adin-Dar by can i n e kidney,MDCK)、非洲绿猴肾细胞(A frican g reen m onkey k i d ney ce l,l Vero)或其他细胞系。此外,利用鸡胚生产流感疫苗,在处理使用后的鸡胚残体时只能采用焚烧或其他无害化的处理方法,既增加成本,又污染环境,而利用细胞生产疫苗则摆脱了对鸡胚的依赖,没有处理鸡胚残体这一环节,既经济又环保[3]。

在人和动物对流感疫苗的需求不断增加的形势下,研制出可以摆脱对鸡胚的依赖、在短期内提供足够疫苗产品以满足流感大规模流行时需要的流感疫苗,已成为目前流感疫苗研制中的方向。用细胞生产流感疫苗,除了在质量、产量上都优于目前的鸡胚,在其他方面的优势如表1所示。

表1鸡胚与细胞培养流感病毒的优缺点

过程优点缺点

鸡胚分离、培养候选疫苗株已经使用多年,工艺成熟高产株多次传代产生不可逆转的突变,鸡胚的供应需要作计划,H3N2难以用鸡胚分离

检测鸡胚疫苗的单向免疫扩散试剂容易在WHO范围内标准化和接受可能低估细胞疫苗的效力

细胞培养分离候选疫苗株范围大、快速需要适宜细胞系的鉴定,外源因子的去除和安全性研究

检查细胞疫苗的单向免疫扩散试剂细胞与疫苗基质细胞必须匹配缺乏细胞系的标准化

细胞培养疫苗的制造可规模化、快速、不依赖于生物材料的供应、清洁、

易于质量控制,生产风险低、纯度高、稳定性好、不

含卵清蛋白

需要研究和发展,外源病毒需要控制,生产

设施比较贵

下面从细胞基质、病毒培养、生产工艺几个方面对使用细胞生产流感疫苗的研究进展加以综述。1细胞基质的研究

过去曾经采用原代鸡肾、鸡胚肾细胞培养制备流感疫苗,现主要使用V ero、MDC K、PER-C6、传代鸡胚肾细胞(PBS-1)等细胞系。这些细胞系无外源因子污染、无致肿瘤性、对流感病毒易感、病毒滴度高,且PBS-1细胞可将病毒释放到液体中,减低了后续工艺的劳动强度。So l v ay、GSK及Ch iron选择MDCK细胞系,B axter-AG选择Vero细胞系, Sano fi-pasetur与C r uce ll公司合作开发PER-C6细胞流感疫苗[4]。

传代细胞如Vero细胞系可用于很多病毒的分离培养,是世界卫生组织和我国生物制品规程许可的疫苗生产细胞系,在160代次以内可用于疫苗生产,如脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗等[5]。在我国5兽用生物制品质量标准汇编6 (2006-2008)中也汇集了一些已采用传代细胞作为基质生产的动物疫苗,如猪细小病毒病疫苗,猪繁殖与呼吸综合征疫苗,猪回肠炎疫苗,犬瘟热、腺病毒、细小病毒、副流感病毒2型呼吸道感染症四联疫苗等。

目前用于甲型、乙型流感病毒增殖和感染性滴度检测的细胞主要是MDC K细胞,并经常用鸡胚培养,进行流感病毒分离。1995年Govo r kova等[6]首次尝试使用V ero细胞分离、繁殖甲型流感病毒,证明V er o细胞是适合流感病毒生长的。1996年乙型流感病毒也得以在V er o细胞上分离成功,并进一步证明在Vero细胞上获得的流感病毒血凝素(H ae m agg l u ti n in,HA)与在MDCK上得到的HA比较,氨基酸序列一致,但与从鸡胚上得到的HA氨基酸序列在196~198上不同。电镜和免疫学试验还证明甲型、乙型流感病毒在Vero细胞上形态变化、感染过程与在MDCK上是一样的。1998年开始,K istner等[7]在奥地利用Vero细胞研制灭活全病毒流感疫苗,免疫BALB/c小鼠后所获得的血凝抑制抗体滴度比鸡胚苗高很多,主要为Ig G1和I gG2a/2b,诱导的T细胞免疫应答和细胞因子都好于鸡胚苗。从Vero细胞最初分离复制病毒,分离株的HA抗原性、遗传稳定性、V er o细胞受体的特异性和流感病毒感染有效性、流感病毒感染V er o 细胞后的蛋白合成和感染病毒后细胞的超微结构变化等方面可得出以下结论:¹Vero细胞可用于临床样本的流感病毒分离,并可有效复制产生较高的感染滴度;º能保持样本中流感病毒HA分子的遗传稳定性;»流感病毒在感染V er o和MDCK细胞时,其蛋白合成过程和细胞形态变化非常相似[8]。2流感病毒的改造、培养

以人用流感疫苗为例,流感疫苗毒株的制备通常是WHO推荐的流行株与国家实验室保存的在鸡胚中具有高滴度的PR8株进行双重感染产生高生长性的重配株(H i g h gro w th reassortan,t HGR),分发给疫苗生产企业用于每年的疫苗生产。用逆向遗传学制备疫苗毒株和传统方法相比具有以下优势:¹定向改造毒株,避免过去传统方法的盲目性、不确定性;º去除没有经过验证的细胞系、野毒株污染或其他病原;»排除HA的致病性,可用于非致病性、高致病性毒株的重配。这样重配的流感病毒疫苗株不但具备流行株的表面抗原(HA和NA),同时也获得PR8毒株的毒力减弱和在细胞中高效复制能力。目前反向遗传学技术多用于流感毒株的改造和细胞适应,以便获得高滴度的病毒。

Ozak i等[9]把野毒株A/Eng land/1/53与在鸡胚中繁殖较快的疫苗株PR8根据2+6策略基因重配,并筛选出Vero细胞生长适应重组株Eng53/v-a。感染Vero细胞后发现Eng53/v-a比PR8繁殖生长得更好,试验证明NS基因(非结构基因)发挥了作用,而NS基因产物在293T细胞中使病毒滴度下降了103~104倍,在M DC K中降低了5倍。M a-sic等[10]用反向遗传学突变了猪流感病毒H1N1 (A/S W/SK/187/02)的HA基因,获得2个突变体,突变体高度减毒并能在MDCK细胞上大量复制,遗传学性质稳定,有望作为疫苗的后选株。

巴斯德研究所对几种不同的细胞系(B HK、V e-ro和MDCK细胞系)、培养基、静止培养、不同类型微载体的转瓶培养,最后通过连续提供新鲜培养基并调整p H值的大容量生物反应器进行研究,在生产过程中添加胰蛋白酶。研究发现Roux瓶或转瓶培养V ero细胞,为获得生长快且产量高的病毒(7d 后HA滴度为256~512/mL),整个过程都应在无血清培养基MDSS2中进行。如采用含血清的培养基进行病毒生产后,在病毒生产阶段采用MDSS2,病毒产量相当低(7d后HA滴度为0~128/mL)。由于病毒HA滴度不会超过128~512/mL,且在病毒接种于V ero细胞与病毒产生之间需要较长的时间。通常用MDCK分离新病毒的细胞实验发现,将无血清培养基略作改进后,可在反应器中灌注培养MDCK细胞,快速大量生产病毒,在无血清条件下生长数代的MDC K细胞生产的病毒产量最高。毒种可以是鸡胚传代株、细胞培养适应株或仅在MDCK细胞中传了1代或2代的新分离病毒[11]。

早期研究发现流感病毒在V er o细胞中不能很好的复制增殖[12-13]。因为流感病毒非裂解的血凝素阻止了病毒对细胞的感染性,通过在细胞维持液中加入适量的胰酶,有效地裂解其血凝素后,使病毒能吸附感染细胞,但在病毒培养过程中病毒滴度下降很快,无法得到大量有效的繁殖,甚至有时测不到HA,没有感染的病毒粒子释放。经培养液胰酶检测发现,胰酶活性在孵育30m in时已完全被灭活,是因为V ero细胞在生长中不断地分泌出一种50~100kD的蛋白抑制因子,并游离于基质中,灭活胰酶的活性。如果在病毒复制过程中间隔补充胰酶量,结果显示病毒的滴度、产率得到极大的提高,即使传5代、10代后病毒滴度仍能维持在较高水平,与在鸡胚中获得的滴度相当[14]。胰酶对流感病毒在大多数细胞中的复制增殖发挥重要的作用,将V ero细胞单层用PBS冲洗3遍,加入含1.0 L g/mL TPC K(Toly lsu lfonyl pheny la l a ny l ch l o ro m ethyl ketone,TPC K,甲苯磺酰苯丙氨酰氨甲酮)-胰酶的M E M-BSA(牛血清白蛋白),在37e、5%CO2条件下,分别在50mL培养瓶、6孔板和24孔板中进行培养,48h后胰酶的活性基本消失殆尽,且50 mL培养瓶下降最快,6孔板次之,24孔板最慢。同时在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)、猪肾细胞(MDSK)和MDCK细胞培养过程中也发现了胰酶活性消失现象,但比在Vero细胞中消失得要慢一些。用V ero细胞在6孔板中进行试验时,当每孔中的培养液量不同时,胰酶的活性降低速度也有不同,2.2mL/孔、3.0mL/孔和4.5mL/孔组培养24h 后,胰酶的最终浓度分别下降为初始浓度的9.1%、30.0%和42.7%,说明单位面积细胞的培养液体积越多,胰酶抑制因子的浓度越低,细胞的生长越好。研究表明,当H1N1和H3N2流感病毒在V er o细胞中连续传15代后,即使反复添加胰酶,病毒的产量也会稍微低于在MDCK细胞中的产量,然而传至10代时,病毒的产量与MDCK细胞相当。因此,流感病毒培养中适量的胰酶是细胞生产病毒不可缺少的因素。

3生产工艺的研究

人用流行性感冒病毒疫苗的工艺技术是19世纪40~50年代发展起来的,每年全球生产3亿5千万人份,每人份含H3N2、H1N1、B型流感病毒HA各15L g,整个过程包括流感的预测、毒株筛选、候选疫苗株的确定、生产、分发等。传统的鸡胚流感疫苗的生产,一般是采用鸡胚接种,经35e培养72h后,置4e冷却过夜,收获尿囊液。分别对不同批次的尿囊液进行无菌、灭活试验血凝滴度检测。合格的尿囊液合并,经10、0.45、0.22L m进行过滤,300kD cut o ff的膜包进行30~50倍浓缩,然后进行蔗糖密度区带超速离心纯化。由于病毒培养方式的改变,后续的工艺也随之改变,呈现提高疫苗的安全性、生产效率的趋势。动物用流感疫苗也用鸡胚生产,但一般没有后期的浓缩和纯化过程。

目前3家公司已获得细胞生产人用流感疫苗的生产许可。V er o细胞生产的流感疫苗已经进行了免疫原性的评价并被批准规模化生产[15]。Bax-ter利用微载体Cytodex-3悬浮培养V ero细胞,批次培养细胞可达2@1013个细胞,接毒感染复数(M ultiplicity of i n fecti o n,MO I)为0.01TC I D50/细胞,病毒吸附1h后加入胰酶,32e~35e孵育48~72h,研制成功了人用季节性流感裂解苗和大流行流感全病毒疫苗,并成功通过了临床试验[16]。生物反应器或W ave r[17]培养M DC K或Vero细胞,培养基有含血清或无血清的,细胞经4d培养,密度可达106~107个/mL,微载体密度2~5g/L,微载体类型为Cytodex1或Cy todex3,病毒滴度HA可达到2.3~2.9log/100L L,MO I为0.05~0.1 TC I D50/细胞。流感季节性流行和可能的大流行促使人们研究快捷的生产方法,K istner等[18]采用野毒株直接在Vero细胞上培养以生产灭活全病毒疫苗。通过30L或100L生物反应器培养流感病毒,病毒滴度达log107~8TC I D50/mL,经灭活,在动物试验中具有较强的免疫原性,可诱导交叉中和抗体、细胞免疫反应,对同型或异型的流感病毒攻击产生保护。最近的一项工艺研究发现,细胞悬浮培养病毒原液的HA达393HAU/100L L,浊度到0.479 OD(700nm),蛋白和DNA含量分别为72L g/mL、5.73L g/mL时进行收获、合并,经0.65L m膜过滤、1/4000B-丙内酯灭活、0.45L m微滤、750kD 切向流滤器超滤、分子筛层析、离子交换层析纯化、配苗等后续工艺,澄清工艺的抗原收获率为79%,微滤工艺收获率为93%,浊度下降2%左右,采用750kD中空纤维柱超滤时,收获率为97%,蛋白和DNA的含量下降分别为16%和33%,浓缩液经Sepharose4F F纯化,HA活性的收获率可达85%,截量每小时处理0.15倍柱体积的浓缩液,蛋白和核酸减少35%和34%,收集的病毒纯化液再经阴离子交换层析纯化,收获率为80%,1mL介质吸附160k HAU的病毒,宿主DNA减少67倍。整个工艺过程的病毒产量50%~60%,总蛋白减少19倍,宿主DNA减少500倍,基本满足细胞流感疫苗的生产需求[19]。也有实验室研究用一种Euony mus eur opaeus的亲和素做配成琼脂糖、纤维素、多聚化合物、玻璃颗粒的亲和介质分离纯化流感病毒。试验结果表明,用纤维素、多聚化合物作成的膜亲和层析比传统亲和层析具有更高的效率,去除DNA的效率达到0.2%~1%,杂蛋白去除率31%~ 50%,和流感病毒具有高亲和性,有希望代替目前的两步层析用于MDCK细胞流感疫苗的纯化[20]。

随着细胞培养制备流感疫苗的研究发展,安全性、有效性的研究也在不断深入。Novatis疫苗公司[21]用MDCK细胞制备的疫苗已通过欧盟Ò期临床试验,和鸡胚流感疫苗相比,具有相同的免疫原性,无明显的轻度、中度反应,在老人和其他人群中具有良好的耐受性。H alperi n等[22]利用M DC K细胞培养流感病毒制成裂解灭活疫苗,对112名健康成人注射此疫苗,同时与同类的鸡胚培养的疫苗比较,结果两种疫苗在注射后的不良反应与免疫后抗体滴度水平均无明显差异,证明细胞培养的流感疫苗是安全有效的,应值得进一步推广。加拿大的Percheson等[23]使用源于M DC K细胞的B V-5F1细胞(被证实无致肿瘤性),经扩增后转至大规模发酵罐中的微载体上培养,接种流感病毒,继续培养,收获的病毒液按照鸡胚培养的裂解流感疫苗的纯化方法进行纯化,主要包括离心、超滤、甲醛灭活、裂解、配苗。然后运用随机、双盲的临床人体观察方法对此类细胞灭活疫苗和鸡胚灭活疫苗同时接种健康人群,结果证明此类新型疫苗在成人试验中是安全有效的。

4今后的研究方向和重点

细胞基质生产流感疫苗,涉及流感病毒分离、流感病毒重配、适应、培养、浓缩、纯化以及质量控制的过程,实际上是生产流感疫苗的安全性、有效性、稳定性,因此我们应在以下环节加强研究:

4.1病毒种子的安全性流感病毒临床样本的分离通常采用MDCK细胞。该细胞系的生物学特性未经验证,同时来自人呼吸道的分泌物以及未验证的细胞系均有潜在的外源病毒污染,不能用于疫苗候选株的培养。使用WHO认证的细胞系分离、培养病毒是保证疫苗、毒种安全性的重要方面。加强细胞基质外源病毒检测是保证疫苗安全的重要环节。目前快速的PC R检测细胞系中特定外源病毒方法获得认证和风险评估[24],可用该方法检测流感病毒株的外源病毒。

4.2临床样本分离方法使用MDC K细胞能成功地分离流感病毒,但V ero、PER-C6等其他细胞系在分离流感病毒的作用如何?是否优于MDCK细胞仍值得研究。

4.3高产重配株与候选疫苗株通过鸡胚感染重配的高产重配株难以在细胞系上生长,需要在细胞上重配的高产株方能作为细胞候选疫苗株。通过逆向遗传学技术进行重组构建候选疫苗株[25]广泛应用于大流行疫苗和活疫苗株的构建,由于其过程采用特殊的PCR基因质粒操作、细菌转化和传代,实际上去除了外源病毒污染,降低了分离病毒株到疫苗病毒株种子批转化的危险,可用于分离病毒的重配、纯化而去除可能的外源污染。因此疫苗公司要加大对该技术的掌握,而不能只依赖国家实验室。

4.4单向免疫扩散(S i n g le Radica l I m munod iffusion Assay,SRD)试剂在SRD分析中,一般要求抗原必须与疫苗中的抗原一致,多数是鸡胚生产的抗原,缺乏细胞生产抗原的分析数据。但也有抗原制备来源不同影响分析结果的报道,因此要加强SRD 分析中抗原来源影响抗原含量的研究。

4.5紧急预防和治疗用抗剂流感疫苗的研制还需时日,因此除有效的药物(如此次甲型H1N1流感中使用达菲)治疗以外,在人和动物(名贵的种用动物或宠物)发生流感的早期,对其感染的个体是否可用有效抗体进行治疗,并对与其接触的小群体用抗体进行紧急被动免疫。利用传代细胞复制分离到的病毒制成抗原,并采用现有的技术制备成精制的抗体,本文认为值得深入研究。

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冯忠泽副所长率团参加第18届国际兽药残留法典委员会会议

2009年5月11日至15日,第18届国际兽药残留法典委员会(CCRVDF)会议在巴西北里奥格兰德州首府纳塔尔召开,来自52个成员国、1个成员组织和5个国际组织的代表出席了会议。由中国兽医药品监察所冯忠泽副所长任团长的中国代表团共8人参加了本届会议。会议主要审议了阿维拉霉素、地塞米松、莫能菌素、甲基盐霉素、替米考星、三氯苯唑、泰乐菌素、醋酸美仑孕酮/甲烯雌醇乙酸酯(MGA)、莱克多巴胺九种兽药残留限量标准、关于兽药使用国家食品安全保障计划的制定与实施指南、CCRVDF抽样分析方法和食品添加剂联合专家委员(J ECFA)优先评估的兽药清单等议题。我国代表团经过不懈努力,赢得了多方支持和理解。大会决定将莱克多巴胺列入J ECFA优先评估的兽药清单进行再评估,并提交今年7月的国际食品法典委员会(CAC)大会审议。代表团还在其他议题上阐明了中方的立场和观点,较为地完成了农业部交办的任务,已于近日顺利回国。