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一、缓冲液的配置：

1.正极缓冲液anode buffer（1X）：

0.2M Tris(pH 8.9):12.114g加H20定容至500ml, 4℃保存。

2.负极缓冲液 cathode buffer (1X):

0.1M Tris +0.1M Tricine+0.1%SDS 不用调pH：

6.057gTris+8.96gTricine+0.5g SDS 加H20定容至500ml, 4℃保存。

3. 凝胶缓冲液 gel buffer(G-B, 3X):

36.342gTris+0.3gSDS加H20定容至100ml H20,HCL调pH 8.45,过滤4℃保存。体积会扩大1/3

4. AB-3 储存液(49.5%T,3%Cmixture):LowBis

24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4℃保存。，体积会扩大1/3

5．AB-6储存液(49.5%T,6%Cmixture):HighBis

23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4℃保存。体积会扩大1/3

二、具体的步骤：

1.按如下配方制备分离胶和积层胶：

                         4% 积层胶(3ml)       10%分离胶(8ml)

AB-3(mL)                             0.25 

AB-6(mL)                                                  1.6

3×gel buffer(mL)                    0.75                 2.67

甘油(mL) --                                               0.63

H20(mL)                              2                    3.1

10% APS(uL)                            22.5                 40

TEMED(uL)                               2.25                 4

先注入分离胶，待分离胶凝固后（0.5-1小时），注入积层胶。待积层胶凝固后（0.5-1小时）。

2. 上样电泳:

    总蛋白取25uL,细胞组分蛋白根据BCA定量后取75ug,加入6×SDS上样缓冲液煮沸5 分钟，12000rpm离心2分钟，取上清进行蛋白电泳。准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V,继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。整个电泳过程在冰上或4℃进行。

3． 转膜和抗体孵育

    1）电泳近结束时，将裁好的与凝胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇浸透活化后，用去离子水漂洗，然后浸泡在转移缓冲液中。另外，裁剪六张尺寸一致的滤纸连同海绵垫一起置于转移缓冲液中浸泡。

    2）电泳结束后，小心取出凝胶，浸泡于转移缓冲液中，在转移缓冲液中安装转移装置，从负极到正极按如下顺序装置：海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫。注意清除各层之间的气泡。转移装置放在搅拌器上并冰浴。连接好电源后，调整电压100V，湿转1-1.5小时。

    3）转膜结束后，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜2次，每次5分钟，之后加入20mL封闭液完全浸泡膜，室温平摇2小时。

    4）根据预染Marker显示的分子量，在相应的范围内，将含有目的蛋白的区域剪下，放入预先准备好的含一抗的封闭液中，用塑料袋封好，4℃缓慢侧摇过夜。

    5）取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜三次，每次10分钟。

    6）在封闭液中按1：10000～20000比例加入辣根过氧化物酶标记的二抗，将膜置于其中，室温侧摇0.5-1小时。

    7）取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜四次，每次10分钟。

4.  化学发光显色：

    1）在暗室中，取等量的Stable Peroxide Solution和Luminiol/Enhancer Solution混匀后，将PVDF膜浸泡其中，轻轻晃动，直至可以看到荧光，一般3～5分钟。

    2）将膜取出，用滤纸吸干多余的液体，放入塑料保护膜中。

    3）将封好的膜放入暗盒中，加入X光片，根据荧光的强弱，曝光5秒～1分钟不等。

    4）取出X光片，放入显影液中，直至条带出现，这时可以根据条带的效果，再次调整曝光的时间。

    5）将显影后的X光片用自来水清洗后，放入定影液中定影5～10分钟，再用自来水后晾干、拍照。

注意事项：配制缓冲液时，丙烯酰胺和TRIS溶液体积会增大，必须定容

PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

　　但是使用PVDF膜前，一定要先用无水甲醇预处理，再在transfer buffer中平衡好才可以使用（PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合）。经过预处理的PVDF膜在转膜时，可以使用不含甲醇的transfer buffer。而使用NC膜时，有的需要用无水甲醇处理，有的则不必，直接用transfer buffer平衡好就可以了。