Tricine-SDS-PAGE具体步骤

Tricine sds page.pdf (209.29k) 

Tricine-sds-page 

一.试剂及缓冲液

AB-3 浓缩胶 : 9.6g丙烯酰胺 0.3g甲叉双丙烯酰胺 溶于20ml水.(49.5%T,3%Cmixture)

AB-6 分离胶 : 9.3g丙烯酰胺 0.6g甲叉双丙烯酰胺 溶于20ml水. (49.5%T,6%Cmixture)

凝胶缓冲液: 1X 2.422gTris 0.02gSDS溶于20ml水,HCL调节pH=8.45.

样品缓冲液:1X 12%SDS,6%mercaptoethanol,30%glycerol,0.05%coomassie blue G-250,150mMTris\\HCL(pH=7.0)

阴极缓冲液: 1X 1.0MTris 1.0MTricine 1%SDS pH约8.25,基本不用调.

阳极缓冲液: 1X 1.0MTris 0.225MHCL pH=8.9, HCL调节.

固定液: 250ml甲醇,50ml冰醋酸, 0.05mol醋酸铵 加水定容500ml.( 0.7mm,30min)

染色液: 0.025%考马斯亮蓝G-250 10%冰醋酸. ( 0.7mm,60min)

脱色液: 10%冰醋酸. ( 0.7mm,2h或者过夜)

二.配胶: 0.07×14×14cm 两块胶的用量.

(一) Separating gel 16%gel

1. AB-6: 5ml

2.凝胶缓冲液: 5ml

3.Glycerol: 1.5g

4.上述加水至15ml

5.10%APS 50ul

6.TEMED 5ul

(二)Spacer gel 10%gel

1. AB-3: 600ul

2.凝胶缓冲液:1ml

3.Glycerol: 0.3g

4.上述加水至3ml

5.10%APS 15ul

6.TEMED 1.5ul

(三)Stacking gel 4%gel

1. AB-3: 500 ul

2.凝胶缓冲液: 1.5ml

3.上述加水至6ml

4.10%APS 45ul

5.TEMED 4.5ul

三.注意:

1.电压:进入分离胶之前30V,之后100 V,在跑至分离胶底部之前可以调至200V.注意温度不能超过35~40℃.

2.本实验适合小蛋白、多肽的分离.1~100kD.

3. Spacer gel 10%gel的用途是为了使1~5 kD的小分子得到更好的分离.是否配制,按照自己需要. 

4. 这是我做了半年摸索出的条件.效果非常好.用它已经很好地分离出我的目标宝贝.和大家一起分享. 

以下是详细说明书：

Tricine/Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Used for pilin processing analysis but generally useful for resolution of small (15-35 Kdal) proteins of similar size. 

See

Strom, M. S., D. N. Nunn, and S. Lory. 1993. A single bifunctional enzyme, PilD, catalyzes cleavage and N-methylation of proteins belonging to the type IV pilin family. Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2404-2408. 

or 

Strom, M. S., and S. Lory. 1992. Kinetics and sequence specificity of processing of prepilin by PilD, the Type IV leader peptidase of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 174:7345-7351. 

Original citation: Schagger, H. and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166: 368-379. 

Reagents: 

Anode Buffer ( ): 200 mM Tris pH 8.9 (can dilute from 10X stock) 

Cathode Buffer (-): 100 mM Tris/100 mM Tricine/0.1% SDS (no need to pH, but will be ~8.25) these can be made as 10X stocks and diluted before use 

Gel Buffer: 3.0 M Tris, pH 8.45/0.3% SDS 

Note: the pH's given for the anode and gel buffers are essential 

Stacking acrylamide: 48% acrylamide/1.5% bis-acrylamide 

Separating acrylamide: 46.5% acrylamide/1.5% bis-acrylamide 

Sample buffer: (add equal volume to sample), for 20 ml:

5 ml 0.5 M Tris, pH 6.8 

4 ml 20% SDS 

1 ml 2-mercaptoethanol 

4 ml 50% glycerol 

0.004 g bromophenol blue 

6 ml water

Pouring Gels 

For each minigel (Hoeffer "Mighty Small" or BioRad "Mini Protean-II"--scale up as required): 

1. Separating gel: 

15% gel 

2 ml separating acrylamide 

2 ml gel buffer 

2 ml 50% glycerol 

10% gel 

1.22 ml separating acrylamide 

2 ml gel buffer 

2 ml 50% glycerol 

0.78 ml water

polymerize with 75 ul 10% APS and 7.5 ul TEMED 

2. Stacking gel:

0.25 ml stacking acrylamide 

0.75 ml gel buffer 

2.0 ml water 

20 ul 10% APS 

2 ul TEMED 

Polymerize both the stacking and separating gels at the same time (I used small disposable tubes), and pour stacking gel directly onto the separating gel (pour carefully but quickly--they won't mix but the separating gel polymerizes within 2-3 minutes). Make each separating gel mixture separately and add TEMED and APS right before pouring. Multiple stacking gel mixtures can be made in the same tube, but you have around 10 minutes before these start to polymerize too. 

Sample loading and electrophoresis: 

For the minigels, 5-10 ul per well gives best results. Layer the samples in the well very carefully, and be sure to flush out any unpolymerized acrylamide before loading. 

Electrophorese at 25-35 mA (constant current) per gel in minigel setup. Foam will appear on the top (cathode), and additional cathode buffer may have to be added during the run. 

好东西 

我的Tricine-SDS-PAGE电泳图，在大分子处有条带，在小分子处无条带，是什么原因 

1、可能分离胶浓度太小，把胶的浓度加大，跑的时候电压小点

2、小分子蛋白含量少，可以加大蛋白上样量 

谢谢luhao82 ，我再按你的建议试试，但是我都是按你的步骤做的啊